基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黨參干預(yù)腸易激綜合征作用機(jī)制研究

蒙潔　陳冬梅　劉佳佳　李丹丹　王晶

摘要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黨參治療腸易激綜合征的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。方法? 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）篩選出黨參口服生物利用度≥30%和類(lèi)藥性≥0.18的化合物作為候選藥效成分，利用HTDocking平臺(tái)預(yù)測(cè)與候選藥效成分匹配的靶蛋白，采用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)GeneCards、NCBI和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)查找腸易激綜合征相關(guān)基因，利用Cytoscape3.7.0繪制疾病基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并與黨參化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)黨參治療腸易激綜合征的關(guān)鍵化合物和潛在作用靶點(diǎn)。使用Funrich3.1.3軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集，對(duì)黨參治療腸易激綜合征的作用機(jī)制做出合理推測(cè)。結(jié)果? 共得到黨參候選藥效成分17個(gè)，預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)111個(gè)，腸易激綜合征相關(guān)基因1368個(gè)，黨參治療腸易激綜合征的關(guān)鍵化合物15個(gè)，潛在作用靶點(diǎn)55個(gè)（包括IL6、PTGS2、AKT1、EGFR、IL2、IL10、IL4等），靶點(diǎn)參與的功能主要有免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等，主要富集通路有TRAILA信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等448條。結(jié)論? 黨參可能通過(guò)調(diào)節(jié)PTGS2等炎癥因子，參與TRAIL信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等途徑，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療腸易激綜合征的目的。

關(guān)鍵詞：黨參;腸易激綜合征;免疫反應(yīng);炎癥因子;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：R259.744;R2-05? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1005-5304（2020）01-0080-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201903174

Study on Mechanism of Codonopsis Radix in Treatment of Irritable Bowel Syndrome

Based on Network Pharmacology

MENG Jie， CHEN Dongmei， LIU Jiajia， LI Dandan， WANG Jing

Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To explore the targets and mechanism of Codonopsis Radix in the treatment of irritable bowel syndrome （IBS） based on network pharmacology. Methods Compounds with oral bioavailability of 30% or more and drug-like ratio of 0.18 or higher in Codonopsis Radix were screened as candidate drug-effect components by TCMSP database， and then the biomacromolecules matched with candidate drug-effect components were extracted by HTDocking platform. The compound-target interaction network was constructed by Cytoscape 3.7.0. The genes for IBS was searched by GeneCards， NCBI and OMIM， and the protein interaction （PPI） network was mapped using cytoscape 3.7.0， and mapping with the compound-target network of Codonopsis Radix revealed the key compounds and potential targets of Codonopsis Radix in the treatment of irritable bowel syndrome. Funrich 3.1.3 software was used to perform GO function annotation and KEGG pathway enrichment on potential targets， and made a reasonable speculation on the mechanism of Codonopsis Radix in the treatment of IBS. Results Totally 17 candidate pharmacodynamic components， 111 predicted targets， and 1368 genes related to IBS were identified. 15 key components of irritable bowel syndrome. There were 55 potential targets， including IL6， PTGS2， AKT1， EGFR， IL2， IL10， IL4， etc.; the main functions involved in the targets were immune response， inflammatory response， etc.， and the main enrichment pathways included TRAILA signaling pathway and TNF signaling

pathway. Conclusion Codonopsis Radix participates in the TRAIL signaling pathway， TNF signaling pathway， etc.， and regulates the immune response through the regulation of inflammatory factors such as PTGS2， so as to achieve the purpose of treating IBS.

Keywords： Codonopsis Radix; irritable bowel syndrome; immune reaction; inflammatory factor; network pharmacology

黨參味甘，性平，有補(bǔ)中益氣、止渴、健脾益肺、養(yǎng)血生津功效。研究表明，黨參及其成方制劑可調(diào)理胃腸運(yùn)動(dòng)功能[1]，但其整體作用機(jī)制尚不清楚。腸易激綜合征是一種臨床常見(jiàn)的胃腸功能性疾病，其發(fā)生與精神緊張、內(nèi)臟高敏感性、胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常、腸道感染有關(guān)[2-5]，而腸道高敏感性可能與腸道免疫狀態(tài)改變有關(guān)[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用胃腸動(dòng)力藥、解痙藥、抗焦慮藥等治療該病，效果不顯著且易反復(fù)，中醫(yī)辨證論治效果良好[7-9]。目前相關(guān)研究大多集中在生理病理學(xué)方面，分子水平的作用機(jī)制研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié)[10]，與中藥多成分-多靶點(diǎn)的特點(diǎn)不謀而合。高通量對(duì)接在線分析平臺(tái)是基于已經(jīng)建立的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，將用戶提交的小分子化合物分別與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行虛擬對(duì)接，從而預(yù)測(cè)出小分子化合物作用靶點(diǎn)的一種反向?qū)臃?wù)器[11]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，聯(lián)合高通量對(duì)接在線分析平臺(tái)，探討黨參治療腸易激綜合征的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，旨在從分子水平探討黨參在治療腸易激綜合征中的整體作用，以期為臨床應(yīng)用提供支持。

1? 資料與方法

1.1? 候選藥效成分及靶蛋白篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選黨參口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18的化學(xué)成分作為候選藥效成分。將候選藥效成分提交至PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）獲得其3D結(jié)構(gòu)，保存為sdf格式，采用ChemOffice2017軟件對(duì)其3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行MM2能量?jī)?yōu)化，并保存成mol2格式，提交至HTDocking平臺(tái)（https：//www.cbligand.org/HTDocking/login.php），篩選分子對(duì)接度最高的前10位靶蛋白作為黨參候選藥效成分的作用靶點(diǎn)，使用Cytoscape3.7.0軟件對(duì)候選藥效成分與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)繪制化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2? 疾病相關(guān)基因獲取

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、OMIM（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“irritable bowel syndrome”為檢索詞，限定條件為人，查找腸易激綜合征相關(guān)基因（包括已經(jīng)被證實(shí)和預(yù)測(cè)的基因），整理查找到的所有基因，形成腸易激綜合征相關(guān)基因數(shù)據(jù)集。使用Cytoscape3.7.0軟件中的string APP插件，對(duì)數(shù)據(jù)集中的所有基因繪制蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3? 黨參治療腸易激綜合征關(guān)鍵靶點(diǎn)和化合物獲取

采用Cytoscape3.7.0軟件對(duì)黨參化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和腸易激綜合征基因PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行映射，獲得黨參治療腸易激綜合征的關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵化合物。

1.4? 關(guān)鍵靶點(diǎn)功能注釋和通路富集

采用Funrich3.1.3軟件對(duì)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集。

2? 結(jié)果

2.1? 黨參候選藥效成分及其靶蛋白

通過(guò)TCMSP篩選得到黨參候選藥效成分17個(gè)，通過(guò)HTDocking平臺(tái)篩選出111個(gè)與之對(duì)接度最高的靶蛋白作為黨參發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，候選藥效成分與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖1，節(jié)點(diǎn)大小代表與其直接相連的邊的條數(shù)多少。候選藥效成分見(jiàn)表1。

2.2? 腸易激綜合征關(guān)鍵基因

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查到83個(gè)相關(guān)基因，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中查到13個(gè)相關(guān)基因，在GeneCards中查到1360個(gè)相關(guān)基因（包括預(yù)測(cè)的基因），去除重復(fù)后共得到1368個(gè)與人類(lèi)腸易激綜合征相關(guān)的基因。對(duì)所有基因繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有1368個(gè)點(diǎn)、44 185條邊，選取部分基因進(jìn)行展示，見(jiàn)圖2，圖中節(jié)點(diǎn)大小代表與其直接相連的邊的條數(shù)多少。

2.3? 黨參治療腸易激綜合征關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵化合物

對(duì)圖1和圖2進(jìn)行映射融合，得到黨參治療腸易激綜合征的關(guān)鍵化合物15種、關(guān)鍵靶點(diǎn)55個(gè)，關(guān)鍵化合物-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)中共有70個(gè)點(diǎn)、90條邊，節(jié)點(diǎn)越大，與其直接相連的邊越多，degree值越大。關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)信息注釋情況見(jiàn)表2、表3。

2.4? 關(guān)鍵靶點(diǎn)功能注釋和通路富集

對(duì)55個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集。關(guān)鍵靶點(diǎn)的細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程富集情況見(jiàn)圖4～圖6。關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG富集通路共448條，顯著性最強(qiáng)的前10條通路見(jiàn)表4。

3? 討論

本研究通過(guò)對(duì)黨參化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)，木犀草素、大豆黃素等15個(gè)化學(xué)成分是黨參發(fā)揮治療腸易激綜合征作用的主要化合物。在本研究發(fā)現(xiàn)的55個(gè)靶點(diǎn)中，木犀草素的作用靶點(diǎn)有31個(gè)，7-甲氧基-2-甲基異黃酮的作用靶點(diǎn)有13個(gè)，豆甾醇的作用靶點(diǎn)有13個(gè)，大豆黃素的作用靶點(diǎn)有9個(gè)，3-羥基亞甲基丹參醌的作用靶點(diǎn)有6個(gè)，色原酮香豆素A的作用靶點(diǎn)有5個(gè)，其余成分的靶點(diǎn)至少有1個(gè)。在黨參治療腸易激綜合征的靶點(diǎn)中，PTGS2的degree值為5，表明PTGS2可能對(duì)黨參治療腸易激綜合征具有較為關(guān)鍵的作用。PTGS2是一種誘導(dǎo)型的即刻反應(yīng)蛋白，正常情況下不表達(dá)，當(dāng)機(jī)體受到某些因素如炎癥因子等刺激時(shí)表達(dá)即刻上升[12]。另外，白細(xì)胞介素（IL）-6、AKT1、IL-2、IL-10和IL-4均參與黨參治療腸易激綜合征的過(guò)程。IL-6是一種與炎性反應(yīng)關(guān)系最為密切的炎性因子[13]。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶依賴(lài)的機(jī)制被胞外信號(hào)激活[14]。IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥免疫抑制因子[15];IL-2是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染等有重要作用;IL-4對(duì)于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用[16]。

有研究表明，腸易激綜合征相關(guān)的通路主要富集在3個(gè)模塊，即炎癥反應(yīng)、腸道功能和精神心理原因[17]。本研究發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)大多與炎癥反應(yīng)相關(guān)，炎癥反應(yīng)相關(guān)通路包括TRAIL信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。TRAIL信號(hào)通路中包含34個(gè)黨參作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，TRAIL分子可以參與到免疫系統(tǒng)細(xì)胞的凋亡中，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控T細(xì)胞的凋亡、自然殺傷細(xì)胞的靶向殺傷等[18]。TNF信號(hào)通路中包含17個(gè)黨參作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，腫瘤壞死因子（TNF）-α可通過(guò)與TNF受體結(jié)合而刺激核因子-κB，從而產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該過(guò)程中的多個(gè)靶點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的招募、炎性細(xì)胞因子的合成、炎癥介質(zhì)的合成，提示炎癥因子參與腸易激綜合征的形成和發(fā)展，且已有研究表明抗TNF可用于治療炎癥性腸病[19]，所以TNF信號(hào)通路可能是黨參治療腸易激綜合征的關(guān)鍵通路。本研究發(fā)現(xiàn)，黨參治療腸易激綜合征的作用靶點(diǎn)主要參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程，這也證實(shí)了腸易激綜合征發(fā)生發(fā)展中存在低度炎癥反應(yīng)[20]。內(nèi)臟高敏感性是腸易激綜合征的一個(gè)重要病因[21]，而低度炎癥狀態(tài)是內(nèi)臟高敏感性的原因之一[22]，因此，通過(guò)緩解腸易激綜合征中的低度炎癥狀態(tài)治療腸易激綜合征是可行的。黨參可能通過(guò)調(diào)控TNF信號(hào)通路和TRAIL信號(hào)通路中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平，發(fā)揮解除腸易激綜合征中的低度炎癥癥狀的作用，從而緩解腸易激綜合征中的內(nèi)臟高敏感性，進(jìn)而達(dá)到治療效果，這一結(jié)論尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和反向分子對(duì)接技術(shù)對(duì)黨參在治療腸易激綜合征中的可能機(jī)制作進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黨參治療腸易激綜合征的化學(xué)成分主要是木犀草素等15種，其發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)主要是PTGS2等55個(gè)。黨參可能通過(guò)對(duì)TRAIL信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等炎癥反應(yīng)通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療腸易激綜合征的作用。本研究可為黨參及其制劑治療腸易激綜合征提供一定的依據(jù)，也可為臨床治療腸易激綜合征及新型藥物的開(kāi)發(fā)提供思路。

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（收稿日期：2019-03-14）

（修回日期：2019-04-18;編輯：陳靜）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81760835）;甘肅省高等學(xué)校科學(xué)研究一般項(xiàng)目（2018A-052）

通訊作者：王晶，E-mail：jwang_lanzhou_2017@163.com