一株好氧反硝化苯酚降解菌的篩選和降解特性分析

張崢 何勍 覃華靜 黃雪容 鄧冬梅

摘要?以苯酚為唯一碳源，通過富集培養方法從焦化廢水生物處理系統的好氧池活性污泥中分離出1株既具有降解苯酚能力也具有反硝化功能的菌株C3。根據16SrDNA序列分析，C3菌株和Pseudomonas?sp.的16SrDNA序列相似性達99%。通過單因素和響應面法確定C3菌株的最優環境條件為pH?7.5、溫度30?℃、初始苯酚濃度1.0?g/L、硝酸鹽氮濃度1.0?g/L，在該條件下，C3菌株對苯酚的降解率為89.3%，對硝酸鹽的降解率為81.3%，降解產物為N2。

關鍵詞?Pseudomonas?sp.;苯酚;好氧反硝化;降解特性

中圖分類號?X172文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0074-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.023

Screening?and?Characterization?of?Phenol?Degrading?Bacteria?with?the?Function?of?Aerobic?Denitrification

ZHANG?Zheng1，2，HE?Qing1，2，QIN?Huajing1，2?et?al

（1.College?of?Biological?and?Chemical?Engineering，Guangxi?University?of?Science?and?Technology，?Liuzhou，Guangxi?545006;2.Guangxi?Key?Laboratory?of?Green?Processing?of?Sugar?Resources，Liuzhou，Guangxi?545006）

Abstract?Using?phenol?as?the?sole?carbon?source，a?strain?C3?with?the?ability?of?degrading?phenol?and?denitrifying?was?isolated?from?the?activated?sludge?of?the?aerobic?tank?of?the?coking?wastewater?biological?treatment?system?by?enrichment?culture.According?to?16SrNDA?sequence?analysis，the?16SrDNA?sequence?similarity?between?C3?strain?and?Pseudomonas?sp.reached?99%.The?optimal?environmental?conditions?of?the?C3?strain?were?determined?by?single?factor?and?response?surface?methodology：?pH?7.5，temperature?30??℃，initial?phenol?concentration?1.0??g/L，nitrate?nitrogen?concentration?1.0?g/L.Under?these?conditions，the?degradation?rate?of?C3?strain?to?phenol?was?89.3%，the?degradation?rate?to?nitrate?was?81.3%，and?the?degradation?product?was?N2.

Key?words?Pseudomonas?sp.;Phenol;Aerobic?denitrification;Degradation?characteristics

基金項目

廣西自然科學基金項目（2017GXNSFBA198099）;廣西重點實驗室基金項目（YB2014201，2016TZYKF10）;廣西高校科學技術研究項目（YB2014201）;廣西高等學校高水平創新團隊及卓越學者計劃資助（桂教人〔2014〕7?號）;2017年廣西國家級大學生創新創業訓練計劃（201710594042）。

作者簡介?張崢（1994—），男，河南南陽人，碩士研究生，研究方向：環境微生物。通信作者，副教授，博士，從事環境微生物方面研究。

收稿日期?2019-07-03;修回日期?2019-07-09

苯酚是環境中主要的水污染物之一，主要來源于煤氣、印染、石油化工等制造業廢水[1-2]，生物處理是目前廢水中苯酚降解的主要途徑[3]。研究表明，苯酚能被多種微生物降解，苯酚降解菌主要包括假單胞菌（Pseudonomonas.?sp）?[4]、酵母菌（Yeast?trichosporon）?[5]、芽孢桿菌（Bacillus.sp）?[6]、根瘤菌（Rhizobia）?[7]、白念珠菌（Candida?albicans）[8]等。為提高廢水中苯酚的降解率，亟需篩選更多高效的苯酚降解菌。

好氧反硝化菌是一種新型反硝化菌，主要存在于芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等，多數為好氧或兼性好氧，并以有機碳作為能源的異養硝化菌[9]。

研究表明，有些苯酚降解菌也具有反硝化功能，好氧反硝化苯酚降解菌的篩選可以為環境中苯酚和氮污染的治理提供有效菌源，也可為更深入探討苯酚降解機理提供研究材料。但目前篩選出的具反硝化功能的苯酚降解菌不多。為此，該研究從焦化廢水活性污泥中分離篩選得到1株好氧反硝化苯酚降解細菌，并對其進行鑒定。進一步研究該菌株的苯酚和硝酸鹽降解及菌株生長情況，并考察環境因素對其苯酚降解能力的影響，為具有反硝化功能苯酚降解菌的實際應用提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株。篩選自柳鋼焦化廢水生物處理系統好氧池中的活性污泥。

1.1.2?培養基。

細菌富集培養使用LB?培養基，包含蛋白胨?10?g/L、酵母膏?5?g/L、NaCl?10?g/L、苯酚（根據需要加入），pH?7.2～7.4。細菌分離和降解試驗中，培養基為無機鹽培養基（mineral?salt?medium，MSM[10]），包含4.26??g/L?Na2HPO4、0.20?g/L?MgSO4·7H2O、0.02??g/L?CaC12、0.05??mg/L?KI、2.00?mg/L?MnSO4·4H2O、0.20??mg/L?CuSO4·2H2O、2.00??mg/L?ZnSO4·7H2O、2.50??mg/L?Na2MoO4·2H2O、82?μg/L?H3BO3、1.00?mg/L?FeC13·6H2O、苯酚，pH?7.2～7.6。固體培養基為在液體培養基中投加15??g/L?瓊脂。

1.2?方法

1.2.1?菌種的馴化和分離。

取10?mL新鮮活性污泥與90?mL無菌水混合振蕩，取5??mL上清液至含不同濃度苯酚的LB培養基中富集培養24?h，培養液依次轉移到含苯酚50、100、200、300、400、500?mg/L的MSM培養基中，30?℃，120?r/min條件下培養6?d。對生長最好的一組培養液菌液，在MSM培養基上進行涂布及平板劃線分離，分離得到純菌株，進一步對篩選的純菌株在含苯酚的LB培養基中培養，測其苯酚降解率，確定其苯酚降解特性。對復篩確認有苯酚降解特性的純菌株，保存在15%的甘油中，-80?℃保存備用。

1.2.2?菌種鑒定。對分離得到的苯酚降解能力最強的苯酚反硝化菌株C3進行革蘭氏染色和16SrDNA測序，以確定其種屬。16SrDNA測序時，首先利用細菌鑒定的通用引物27F?和1492R[11]對菌液進行PCR?片段基因擴增，引物由上海生工有限公司合成。反應體系（50?μL）包括：?25??μL?DNA?聚合酶mix，菌液模板4?μL，去離子水17?μL，上下游引物各2?μL。PCR溫度程序為：94?℃預變性8?min，94?℃變性1?min，58?℃退火1??min，72??℃延伸1?min，循環29次，最后72?℃終延伸10??min，4?℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，純割膠化PCR產物。將回收的DNA送往上海立菲生物技術有限公司廣州分公司進行序列測定;將序列在NCBI網頁上進行BLAST同源性比對。

1.2.3?菌株降解條件及降解特性研究。以苯酚降解率為指標，利用單因素試驗研究pH、溫度和初始苯酚濃度對菌株生長及降解苯酚的影響，根據環境單因素試驗結果，用Design-Expert軟件生成3水平3因素組合條件（表1），根據所生成的各組合條件搖床培養菌株，測定培養2?d后苯酚濃度，計算降解率，所得結果輸入Design-Expert軟件，進行分析。將C3菌在響應面法所確定的最優條件下進行搖床培養，每隔5?h測定苯酚濃度、硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度以及菌液濃度，繪制生長曲線和苯酚降解曲線。

苯酚降解率=苯酚降解前濃度-苯酚降解后濃度苯醛降解前濃度×100%

1.2.4?分析方法。

菌種濃度的測定采用比濁法，使用分光光度計于波長600?nm?處測定其OD?值[12]。苯酚含量采用4-氨基安替比林分光光度法[11]測定;NO3--N含量利用二磺酸分光光度法測定;NO2--N含量利用N-?（1-萘基）-乙二胺光度法測定[13]。

2?結果與分析

2.1?苯酚降解反硝化菌篩選鑒定

通過富集、初篩和復篩得到1株革蘭氏陽性的反硝化苯酚降解菌株C3，菌落灰白色、蠟質、圓形、邊緣整齊平滑。C3菌株在pH=7、30?℃、120?r/min、苯酚濃度為1?000?mg/L條件下對苯酚降解能力達86%。革蘭氏染色證明C3菌株為革蘭氏陽性，對C3降解菌菌株的16SrDNA序列進行BLAST同源性比對，?發現其與Pseudomonas?sp.序列接近，同源性高達99%，因此初步鑒定該菌株為Pseudomonas?sp.（假單胞菌菌屬）。目前研究表明，苯酚降解菌大部分屬于假單細胞菌屬[14]，但有關其反硝化能力的研究報道很少。

2.2?環境因素對菌株苯酚降解和反硝化能力的影響

2.2.1?pH對苯酚降解率的影響。

如圖1所示，初始pH在6.5～8.0之間，C3菌體對苯酚均有一定降解率，pH=7.5左右時，C3對苯酚的降解率最高，達78%。圖2表明，隨著C3菌株對苯酚的降解，培養液中pH呈下降趨勢，降解10?h后，pH由7降至5，苯酚降解菌Comamonas?testosterone中也發現類似的變化趨勢[15]。這可能是因為苯酚降解菌在微生物降解苯酚時，需要將苯酚開環為有機酸，才能進一步為微生物利用，所以生長降解過程中培養液pH逐步下降呈酸性。

2.2.2?苯酚初始濃度對苯酚降解率的影響。圖3表明，初始苯酚濃度為1?000?mg/L時，C3的苯酚降解率最大（99%）;苯酚濃度高于1?500?mg/L時，降解率呈緩慢下降趨勢，但下降幅度不大;苯酚濃度為2?200?mg/L時，降解率依然高于80%。高濃度苯酚對C3苯酚降解速率的影響可能與苯酚對微生物的毒性有關。

2.2.3?溫度對苯酚降解速率的影響。在20～30?℃之間，C3的苯酚降解速率隨溫度的增加而提高，溫度高于30?℃時，苯酚降解率隨溫度的增加而降低，在25～35?℃苯酚降解速率較快。

2.2.4?響應面分析。

如表2所示，在設計的試驗條件下，苯酚最大降解率達到89%，最小降解率為24%。

將表2?中的結果導入Design-Expert?軟件，固定一個環境因素的情況下，以另外2個環境因素為X?和Y?軸，以降解率為Z?軸作圖，得到不同降解條件下的苯酚降解率響應曲面。如圖5所示，溫度和底物濃度、pH和底物濃度、溫度和pH對降解率的交互影響均不太顯著。由圖5還可知，C3菌株降解苯酚的最優條件為：溫度30?℃、pH?7.5、底物濃度1?000?mg/L，在該條件下培養2?d后，對苯酚的降解效率達89%。

2.3?C3菌株生長曲線及降解特性

圖6表明，培養28～32?h時，C3菌株進入對數生長期，菌株生長和苯酚降解及硝酸鹽氮的消耗是同步的，培養60?h后，苯酚濃度從1?000?mg/L降解到107?mg/L，苯酚降解率達89.31%，，硝酸鹽濃度從1?000?mg/L降解到187?mg/L，硝酸鹽降解率達81.30%。C3菌株生長過程中伴有亞硝酸鹽積累，其中開始生長時，亞硝

酸鹽積累很少，但在接近對數期時有明顯的積累，于28?h達到最大值660?mg/L，之后逐步下降，到第60?h，亞硝酸鹽濃度降為50?mg/L。C3的硝酸鹽降解及生長曲線符合好氧反硝化酶系理論，與已報道的好氧反硝化菌Diaphorobacter?sp.PDB3[10]相似。與Zhang等[16-17]報道反硝化細菌降解過程中也有亞硝酸鹽的積累不一致，可能是因為初始硝酸鹽降解為亞硝酸鹽的速率高于亞硝酸亞降解速率，隨硝酸鹽濃度降低，硝酸鹽降解為亞硝酸鹽的速率逐漸降低。

3?結論

（1）以苯酚為唯一碳源，NO3-為唯一氮源，從焦化廢水中篩選出了1株同時具有降解苯酚和反硝化能力的菌株C3，經16SrDNA測序鑒定為Pseudomonas?sp.。

（2）C3降解苯酚的最優條件為：pH?7.5、溫度30?℃、初始苯酚濃度1?000??mg/L、硝酸鹽氮濃度1.0?g/L，此時C3菌株的苯酚降解能力最高，在該條件下培養60?h后，C3苯酚降解率為89%，NO3-去除率達81%。

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