假單胞菌增殖培養基中碳源氮源的優化

宮達非 廖靜云 曾慧帆 尚常花

摘要?[目的]提高假單胞菌的增殖，降低生產成本。[方法]采用光電比濁法，通過單因素試驗對假單胞菌增殖培養基的碳源和氮源進行優化。[結果]?假單胞菌增殖培養基中最佳的碳源、氮源種類與濃度分別為蔗糖0.5?g/L、魚蛋白胨1.2?g/L。[結論]通過對增殖培養基的優化，降低了生產成本。

關鍵詞?假單胞菌;碳源;氮源;優化

中圖分類號?Q93-33文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0083-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.025

Optimization?of?Carbon?and?Nitrogen?Sources?of?Enrichment?Medium?for?Pseudomonas

GONG?Dafei1，2，LIAO?Jingyun1，2，ZENG?Huifan1，2?et?al

（1.College?of?Life?Science，Guangxi?Normal?University，Guilin，Guangxi?541006;2.Key?Laboratory?of?Ecology?and?Environmental?Protection?of?Rare?and?Pndangered?Animals?and?Plants，Ministry?of?Education，Guilin，Guangxi?541006）

Abstract?[Objective]To?improve?the?proliferation?of?Pseudomonas?and?reduce?the?production?cost.[Method]?The?photoelectric?turbidimetry?method?was?used?to?optimize?the?carbon?and?nitrogen?sources?of?Pseudomonas?enrichment?medium?by?single?factor?test.[Result]The?optimal?carbon?source?and?nitrogen?source?species?and?concentration?in?Pseudomonas?enrichment?medium?were?sucrose?0.5?g/L?and?fish?protein?1.2?g/L，respectively.?[Conclusion]By?optimizing?the?enrichment?medium，the?production?cost?was?reduced.

Key?words?Pseudomonas;Carbon?source;Nitrogen?source;Optimization

基金項目?廣西高校中青年教師基礎能力提升項目（2018KY0086）;廣西師范大學博士科研啟動基金項目（2017BQ015）;廣西研究生教育創新計劃項目（JGY2019009）。

作者簡介?宮達非（1996—），女，?吉林四平人，碩士研究生，研究方向：微生物學與分子生物學;廖靜云（1994—），女，廣西來賓人，本科，專業：生物科學;曾慧帆（1997—），女，海南澄邁人，本科，專業：生物科學。宮達非、廖靜云、曾慧帆為共同第一作者。通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事微生物學與分子生物學研究。

收稿日期?2019-08-15;修回日期?2019-09-20

假單胞菌屬（Pseudomonas）隸屬于薄壁菌門假單胞菌科，該屬由Migula在1894年創立，包括200余種細菌[1]。它們大多為革蘭氏陰性桿菌，形態上有直的和彎曲的，非常細小，有單鞭毛或多鞭毛，并以鞭毛運動，沒有芽孢[2]。只能在有氧環境中生存，多分布于土壤、水體及植物體內，在pH?7.0～8.5的范圍內生長。能在4～43?℃下生長，生長溫度范圍廣泛，但大部分菌的生長溫度是30?℃，分解有機物的能力很強，而且可將多種有機物作為能量來源[3-4]。

假單胞菌對紫外線、消毒劑等殺菌手段，都有較強的抵御能力。研究發現，在人體的皮膚、呼吸道和腸道等部位假單胞菌也普遍存在[5]。此外，假單胞菌在生物防治等方面起著非常重要的作用。它能產生植物生長所需要的調節物質和抗生素，降解有毒物質，促進植物進行營養生長;它能通過殺掉害蟲而起到生物防治的作用;其模式種的耐藥機制研究對醫學發展有重要的指導意義[6]。

該研究選用的假單胞菌Cr13由該實驗室對從河池市南丹縣大廠鎮礦區獲得的重金屬污染土壤進行平板篩選后獲得，該菌株可以耐受高濃度的六價鉻。為了降低假單胞菌的培養成本，促進該菌種的產業化生產，筆者通過單因素試驗對菌株Cr13增殖培養基的碳源和氮源進行優化。

1?材料與方法

1.1?材料?假單胞菌Cr13由珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室提供。培養假單胞菌所用的碳源（牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、半乳糖和甘露糖）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸、硝酸銨、硝酸鉀、脲）、NaCl及瓊脂等均從廣西卓一生物技術有限公司購買。

1.2?儀器?722型光柵分光光度計（上海市第三分析儀器廠）;LYZ-1102恒溫搖床（上海龍躍儀器設備有限公司）;ZHJH-C1106B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（三洋電機株式會社）;PH-18-FA1104分析天平（北京精測電子科技有限公司）。

1.3?方法

1.3.1?培養基。?牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0?g、蛋白胨10.0?g、NaCl?5.0?g、蒸餾水1?000?mL，pH?7.4～7.6，115?℃滅菌30?min備用。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：在牛肉膏蛋白胨培養基的基礎上加入2%瓊脂。

1.3.2?菌種活化。?取-70?℃保存的菌種在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上劃線，挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，28?℃培養24?h，作為種子液備用。

1.3.3?假單胞菌增殖培養基的優化。?以牛肉膏蛋白胨培養基作為基礎培養基，1%接種量，28?℃恒溫培養，測定吸光度值。通過單因素試驗對培養基中的碳源、氮源進行優化，確定最佳碳源、氮源的種類以及濃度。

（1）碳源優化。以牛肉膏蛋白胨培養基作為基礎培養基，分別以相同濃度（0.3%）的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、半乳糖和甘露糖替換牛肉膏，其他成分及含量保持不變，考察不同種類碳源對假單胞菌增殖的影響。再依據試驗結果篩選最適宜的碳源種類，并對其進行碳源濃度優化試驗。

（2）氮源優化。?以牛肉膏蛋白胨培養基作為基礎培養基，分別以相同濃度（1%）的6種有機氮源（胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚蛋白胨、酵母粉、L-色氨酸、酪蛋白氨基酸）和3種無機氮源（硝酸銨、硝酸鉀、脲）替換蛋白胨進行試驗，其他成分及含量保持不變，考察相同濃度、不同種類的蛋白胨對假單胞菌增殖的影響。然后再依據試驗結果篩選最適宜的氮源種類，考察氮源的不同濃度對假單胞菌增殖的影響。

1.3.4?光電比濁法測定生物量。接種后的增殖培養基于28?℃恒溫培養。到穩定期后菌液用培養基適當稀釋，以相應的空白培養基（不接種菌）作為對照，利用分光光度計測定OD600值。以進入穩定期后的3個平行組求平均值，以此確定生物量。

2?結果與分析

2.1?不同種類碳源對假單胞菌的影響

碳源是一類可以影響假單胞菌生長繁殖及胞外多糖和抗生素等代謝產物合成的營養物質[7-8]，因此適宜的碳源種類有利于假單胞菌的生長繁殖。該研究表明，以蔗糖作為假單胞菌增殖培養基的碳源時，吸光度值最高，其次是牛肉膏和半乳糖（圖1）。說明蔗糖對假單胞菌的生長繁殖有良好的效果，而且蔗糖的價格也很低。綜合考慮，該研究將進一步考察不同蔗糖濃度對假單胞菌增殖的影響。

2.2?不同種類氮源對假單胞菌的影響

圖2表明，除了L-色氨酸作為有機氮源時菌株生長較慢，其他有機氮源促進菌株生長的效果都優于無機氮源。其中，魚蛋白胨作為氮源時培養假單胞菌的效果最好，吸光度值最高。其次是酵母粉與酪蛋白胨，而且魚蛋白胨的價格也很低。綜合考慮，該研究將進一步考察魚蛋白胨的不同濃度對假單胞菌增殖的影響。

2.3?不同濃度的碳源對假單胞菌的影響?采用單因素試驗考察碳源蔗糖的最佳濃度。結果表明，當蔗糖濃度在0.5～3.5?g/L的范圍內變動時，蔗糖濃度的增大對假單胞菌生長的影響并不顯著（圖3）。綜合考慮成本因素，選擇0.5?g/L為蔗糖最適濃度。

2.4?不同濃度的氮源對假單胞菌的影響?采用單因素試驗考察氮源與蛋白胨的最佳濃度。結果表明，不同濃度魚蛋白胨對假單胞菌生長的影響比較顯著，但當魚蛋白胨濃度達到1.2?g/L后，濃度繼續增大對假單胞菌生長的影響并不顯著（圖4）。綜合考慮成本因素，選擇1.2?g/L為魚蛋白胨最適濃度。

3?討論

該研究發現，用蔗糖作為碳源時，培養假單胞菌Cr13的效果最為明顯，其次是半乳糖和可溶性淀粉。但是葡萄糖對假單胞菌Cr13生長的效果就較差，這與孫承文等[9]、郭叢等[10]的研究中以葡萄糖作為碳源時對假單胞菌生長影響顯著的試驗結果不同，該研究確定的最適碳源蔗糖與王宇等[11]、譙天敏等[12]等所得的最適碳源一致，表明不同的假單胞菌菌株其最適碳源種類差別較大。

該研究表明，假單胞菌Cr13對不同種類氮源具有偏好性，有機氮源明顯優于無機氮源，這可能是因為有機氮源除了可以提供氮源外，還含有豐富的氨基酸和維生素等物質，為假單胞菌Cr13的繁殖提供了有利的條件[13]。

參考文獻

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[9]?孫承文，賴迎迢，任小波，等.草魚銅綠假單胞菌滅活疫苗發酵培養基的優化及其在發酵罐的生長試驗[J].大連海洋大學學報，2019，34（1）：15-20.

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[11]?王宇，吳洪檳，劉松鑫，等.降解膽固醇的假單胞菌DGC-2的發酵培養基和培養條件[J].信陽師范學院學報（自然科學版），2012，25（4）：465-468.

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[13]?朱丹鳳，王園園，崔樹茂，等.羅伊氏乳桿菌氮源利用的選擇性與特征分析[J].食品與發酵工業，2018，44（11）：35-41.