無窖泥發酵生產濃香型白酒

任雪，魏曉慶，韓雨辰，李洋，肖冬光

(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

中國傳統白酒由于其獨特的發酵工藝和產品風格，在世界六大蒸餾酒中占有重要的地位，而作為中國傳統白酒的典型風味代表之一的濃香型白酒，其生產量最大，國家名酒品牌最多，深受消費者喜愛[1-4]。傳統濃香型白酒釀造工藝的獨特之處在于“泥窖固態發酵，續糟配料，混蒸混燒”，泥窖除了作為蓄積酒醅進行發酵的容器外，還與各種呈香呈味物質的生成密切相關。以己酸菌群為主的泥窖微生物和以酵母菌群、乳酸菌群為主的酒醅微生物相比，各自的生長和代謝條件不同，但都在發酵過程中進行著復雜的物質代謝與交換，最終形成了濃香型白酒獨特的成分構成和風味特征[5-8]。濃香型白酒的特征香味成分是己酸乙酯，它與適量的乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和其他香味成分組成復合香氣，其四大酯比例協調，具有窖香濃郁，綿甜凈爽的特點[9-13]。

由于傳統濃香型白酒泥窖發酵的特殊方式，使得糟醅出入窖池很大程度上依賴于人工操作，勞動強度大，機械化程度低[14]。而且由于窖泥的存在，常給原酒帶來土腥味和泥臭味[15-16]，需要進行一系列復雜的處理，從而增加了凈化成本[17-18]。針對以上問題，研究人員提出了一系列解決辦法，河套酒業采用“行車抓斗”出窖，形成有序的物料輸送鏈條，降低勞動強度[19]。但這種方式容易把窖泥帶到蒸餾酒醅中，影響原酒質量；為了不使原酒帶有泥臭味，對接近窖壁的酒醅只能采用傳統方式人工出窖，費時費力，且不便于管理。

為了打破泥窖對濃香型白酒機械化的限制，本研究先對己酸菌群單獨培養，待前發酵酒醅中的乙醇含量到達高峰時再混入己酸發酵液進行后發酵，最終確定己酸發酵液添加量、添加時間及總發酵周期，從而繞開泥窖實現無窖泥發酵生產濃香型白酒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料和試劑

原料：高粱、濃香型大曲、酒糟、優質窖泥，均取自某濃香型酒廠。

試劑：(NH4)2SO4、K2HPO4、乙醇，天津市風船化學試劑科技有限公司；乙酸鈉、CaCO3、MgSO4，天津市化學試劑一廠；酵母浸粉，北京奧博星生物技術公司。以上均為分析純。

1.1.2 主要培養基

己酸菌種子培養基(g/L)：乙酸鈉5，(NH4)2SO40.5，K2HPO40.4，MgSO40.2，酵母浸粉1，自然pH，121 ℃滅菌20 min，在干熱滅菌后接種前加入10 g/L CaCO3，過濾除菌后加入體積分數為20%無水乙醇[20]。

己酸菌發酵培養基(g/L)：乙酸鈉7，(NH4)2SO40.5，K2HPO40.4，MgSO40.2，酵母浸粉5，自然pH，121 ℃滅菌20 min，于干熱滅菌后接種前加入10 g/L CaCO3，過濾除菌后加入體積分數為15%無水乙醇。

1.2 分析方法

乙醇體積分數的測定：采用酒精計法[21]；酸度的測定：采用酸堿滴定指示劑法[22]；殘淀粉的測定：采用斐林試劑法[23]。

主要風味物質的測定[24]：取100 g酒醅，加入200 mL蒸餾水，蒸餾并接取酒液100 mL，充分混勻，取樣進行氣相色譜法測定。檢測條件：Agilent HP-INNOWAX色譜柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；載氣為高純氮氣(>99.999%)；柱流速為0.8 mL/min；進樣口溫度200 ℃；檢測器溫度150 ℃；程序升溫，起始溫度50 ℃，保持8 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持15 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比為10∶1。

1.3 實驗方法

1.3.1 己酸發酵液的制備

選取優質窖泥，85 ℃水浴處理10 min，置于30～35 ℃厭氧培養7～12 d，挑選產氣較多的菌液，補充新的培養基繼續熱處理，連續富集培養3次，得到己酸菌富集菌液[25]。

取己酸菌富集菌液按7%的接種量接種于發酵培養基，于35 ℃培養箱中厭氧培養，從發酵第6天開始，每天取樣進行己酸和丁酸的測定，確定最終發酵時間，使己酸含量達到10 g/L左右，且己酸、丁酸比例適宜。

1.3.2 前發酵工藝

原料粉碎：以優質高粱為原料，粉碎度要求通過20目孔篩占70%～75%以上。

潤料：高粱粉用相當于原料質量60%的60～70 ℃水拌勻，堆積潤料18～20 h。

蒸料：潤好的物料拌入相當于高粱粉質量20%的稻殼(已清蒸過)，拌勻后蒸料，圓汽后蒸1 h。

配料發酵：蒸熟的物料冷卻至30 ℃左右，拌入傳統發酵的酒糟，配糟比(高粱∶新鮮酒糟，質量比)為1∶3～4，以配料后物料可發酵淀粉含量16%～18%、酸度1.6～2.0 mmol/10 g為宜，拌入濃香型大曲粉的質量相當于高粱質量的10%～12%，裝瓶，30 ℃下靜置發酵，發酵開始后每天進行稱重，發酵至第4天開始，每天取樣進行乙醇體積分數和殘淀粉的測定，依據指標確定前發酵時間。

1.3.3 后發酵

1.3.3.1 己酸發酵液添加時間的確定

按照1.3.2的方法進行前發酵，分別在發酵至第5、6、7、8天添加0.40 g/kg己酸發酵液，繼續后發酵至第14天，取樣分析，確定己酸發酵液的添加時間。

1.3.3.2 己酸發酵液添加量的確定

按照1.3.2的方法進行前發酵，在發酵至第6天時，分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/kg的己酸發酵液，繼續后發酵至第14天，取樣分析，確定己酸發酵液的添加量。

1.3.3.3 總發酵周期的確定

按照1.3.2的方法進行前發酵，在發酵至第6天，添加0.40 g/kg的己酸發酵液，進行后發酵，分別在發酵至第14、21、28、35、42天，取樣分析，確定最終發酵周期。

2 結果與分析

2.1 己酸發酵液培養時間的確定

按照1.3.1的方法，將己酸菌富集菌液接種于發酵培養基中，培養至第6天時開始產生輕微氣泡，之后每天取樣，測定己酸、丁酸含量，產酸情況如圖1所示。培養6～9 d，己酸含量逐漸增加，且增長幅度較大，而丁酸含量呈現降低趨勢，繼續延長培養時間，己酸、丁酸的含量均趨于平穩，當培養至第9天時，己酸含量為9.651 g/L，丁酸含量為2.031 g/L。

圖1 己酸、丁酸產量隨發酵時間變化情況

根據文獻報道，丁酸是己酸合成過程中的底物之一[26]，所以隨著己酸含量的增加，丁酸含量有降低趨勢，當發酵至第9天時，己酸、丁酸含量均趨于平穩，且己酸、丁酸的比例較適宜，因此確定發酵時間為9 d。

2.2 前發酵時間的確定

按照1.3.2的方法進行前發酵。前發酵過程中，乙醇體積分數、殘淀粉以及失重隨著發酵時間的變化情況如圖2所示。隨著發酵的進行，失重和乙醇體積分數先增加后趨于穩定，殘淀粉先降低后趨于穩定。酒醅菌群主要是以酵母菌和乳酸菌等兼性厭氧菌或好氧菌為主要菌群，而窖泥菌群是以己酸菌等厭氧菌為主要菌群，它們的生長環境和代謝機制不同，酵母發酵產生的酒精對己酸菌群有抑制作用，而窖泥菌群發酵產生的己酸等代謝物對釀酒酵母也有抑制作用。如果己酸發酵液添加時間過早，己酸、丁酸等代謝物會對酵母的生長和代謝產生抑制作用，使發酵不徹底，殘淀粉過高而乙醇含量過低；如果己酸發酵液添加時間過晚，己酸、丁酸等與乙醇的酯化時間短，會導致合成的風味物質不足。當發酵6～8 d，乙醇含量達到高峰，所以應該選擇在此時間段內添加己酸發酵液。

圖2 前發酵過程中主要理化指標變化情況

2.3 后發酵

前發酵結束后，添加己酸發酵液，進行后發酵，根據各項理化指標，確定己酸發酵液的添加時間、添加量和總發酵周期。

2.3.1 己酸發酵液添加時間的確定

己酸發酵液添加時間對乙醇體積分數、殘淀粉的影響如圖3所示。

圖3 己酸發酵液添加時間對乙醇體積分數、殘淀粉的影響

隨著己酸發酵液添加時間的延后，乙醇體積分數逐漸上升，殘淀粉逐漸降低。說明己酸發酵液添加時間過早會影響酒醅中酵母菌生長、代謝，進而影響乙醇體積分數和殘淀粉的含量。

不同時間添加己酸發酵液對主要風味物質的影響如表1所示。隨著己酸發酵液添加時間的延后，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量呈現增加的趨勢，而己酸乙酯和丁酸乙酯的含量呈現降低的趨勢，總高級醇的合成量差異不顯著。因為隨己酸發酵液添加時間的延后，己酸、丁酸與乙醇的作用時間縮短，導致己酸乙酯和丁酸乙酯的含量降低；而過早添加己酸發酵液會抑制大曲中酵母菌群和乳酸菌群的生長和代謝，進而影響乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成。綜合己酸發酵液添加時間對主要風味物質、乙醇體積分數以及發酵酒醅中物質利用情況，選擇發酵6 d時添加己酸發酵液。

表1 己酸發酵液添加時間對主要風味物質的影響 單位:mg/L

注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 己酸發酵液添加量的確定

如表2所示，隨著己酸發酵液添加量的增多，乙酸乙酯含量逐漸增加，乳酸乙酯含量呈降低趨勢，己酸乙酯含量先增加后變化不顯著，而丁酸乙酯含量變化不顯著。

從高級醇來看，正丙醇和異戊醇含量隨著己酸發酵液添加量增多而減少，異丁醇和苯乙醇含量變化不顯著。由于添加過多的己酸發酵液沒有顯著提高己酸乙酯含量，并且會導致酒體中剩余過多的己酸，影響酒體平衡，綜合來看，選擇己酸發酵液的添加量為0.40 g/kg。

表2 己酸發酵液添加量對主要風味物質的影響 單位:mg/L

2.3.3 發酵周期的確定

從表2可以看出，通過提高己酸發酵液的添加量不能顯著增加己酸乙酯和丁酸乙酯的含量，因此要延長發酵時間使己酸、丁酸和乙醇在大曲酯化酶的作用下繼續合成己酸乙酯和丁酸乙酯，確定最終發酵周期使濃香型白酒四大酯比例協調，己酸乙酯香氣突出。

如圖4所示，隨發酵周期的延長，乙醇體積分數有降低的趨勢，酸度有增加趨勢，殘淀粉基本穩定。因為合成酯類以及揮發等因素影響，酒精會有所消耗，所以乙醇體積分數略微降低，而隨著發酵周期的延長，一些有機酸會增加，所以酸度有增加趨勢。

圖4 發酵周期對乙醇體積分數、酸度以及殘淀粉的影響

如表3所示，隨發酵周期的延長，乙酸乙酯含量呈現略微降低趨勢，乳酸乙酯含量變化不顯著，己酸乙酯和丁酸乙酯的含量均顯著增加；從高級醇方面看，總體呈現降低趨勢。由于發酵時間的延長，乙酸乙酯逐漸被分解而有所降低，而己酸、丁酸與乙醇逐漸合成己酸乙酯和丁酸乙酯，所以均呈現升高的趨勢。綜合看來，發酵周期為42 d時，四大酯比例較協調，且酒精含量維持在一定水平，符合濃香型白酒質量標準，因此，確定最終發酵周期為42 d。

表3 發酵周期對主要風味物質的影響 單位:mg/L

3 結果與討論

從實驗結果來看，己酸發酵液添加時間、添加量以及總發酵周期，對濃香型白酒四大酯的平衡起到很大作用。若己酸發酵液添加時間過早，對乙酸乙酯和乳酸乙酯的合成有抑制作用，而添加過晚會影響己酸乙酯和丁酸乙酯的合成。當總發酵周期為14 d(表2)，己酸發酵液的添加量由0.20 g/kg增加至0.40 g/kg時，己酸乙酯的含量增加了35.46%；再加大己酸發酵液的添加量，己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加不顯著，而乙酸乙酯的含量明顯增加，乳酸乙酯含量有所下降，說明在發酵周期較短的情況下并不能通過加大己酸發酵液的量來提高己酸乙酯的含量。通過延長發酵周期可顯著提高己酸乙酯的含量(表3)，丁酸乙酯的含量也有所增加，乙酸乙酯的含量稍有下降，而乳酸乙酯的含量變化不明顯，四大酯比例趨于平衡。由此可見，可以通過對己酸發酵液添加時間、添加量以及總發酵周期的調控來有效控制四大酯的含量并協調其比例，從而實現無窖泥發酵生產濃香型白酒的目的。