黑菊芋中5-羥甲基糠醛制備及含量分析

楊慶麗，張旭，石杰，董艷，張正海，姬妍茹*

黑龍江省科學院大慶分院（大慶 163319）

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5- HMF）又稱羥甲基糠醛、5-羥甲基-2-呋喃糠醛等，是葡萄糖，果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產生的醛類化合物，其穩定性不高，對空氣和光敏感性高，需要在低溫下保存[1-2]。5-HMF是美拉德反應終產物類黑精形成的中間體，廣泛存在于蜂蜜、果汁、醋、乳制品、餅干和咖啡等烘焙食品中，尤其是碳水化合物含量豐富的食品[3]。目前，對于5-HMF仍有許多爭議，其安全性引起了人們的關注。

菊芋（Jerusalem artichoke）又名洋姜、鬼子姜，菊科向日葵屬，多年生草本植物。菊芋塊莖菊糖含量豐富，約占干物質70%～90%[4]。有研究表明菊糖在加熱情況下可轉化成果糖進而生成5-HMF[5]。黑菊芋是菊芋塊莖在變溫條件下發生美拉德反應生成的一種新型食品。其色澤黑亮，口感香甜富有彈性，能夠滿足廣大消費的需求，具有較好的市場前景。黑菊芋等熱加工食品中5-HMF的相關研究顯得尤為重要。因此，研究對黑菊芋加工及保存中5-HMF含量變化進行分析，并與幾種常見的果脯及咖啡進行比較，以期為黑菊芋的食用安全性評價提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白皮菊芋，黑龍江省科學院大慶分院基地種植；甲醇（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5-HMF標準品，北京中科儀友化工技術研究院；黑菊芋、黑蒜，黑龍江省科學院大慶分院；嘉應子、烏酸梅，武漢稻香春食品廠；黑咖啡，德國格蘭特；鐵氰化鉀（分析純），沈陽市華東試劑廠；草酸、乙酸鉛等為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Master-D UF實驗室超純水機，上海和泰儀器有限公司；LC-15C高效液相色譜，日本島津；臺式高速冷凍離心機，上海天美科學儀器有限公司；黑菊芋加工設備，黑龍江省科學院大慶分院自制；HPX-9082數顯電熱培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑菊芋中5-HMF提取方法優化

黑菊芋充分研磨后取1 g，分別以提取溫度、料液比、提取時間、甲醇體積分數作為考察對象。采用單因素、正交試驗，研究最佳提取參數。提取溫度分別為25，30，35，40，45和50℃；料液比分別為1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8和1∶9（g/mL）；時間分別為1，2，3，4，5和6 h；甲醇體積分數分別為0（蒸餾水），10%，20%，30%，40%和50%；以5-HMF含量為指標測定提取率。

1.3.2 5-HMF含量分析

以1.3.1中的最優條件提取黑菊芋5-HMF后，提取液根據NY/T 1332—2007中6.1.2及6.1.3分析5-HMF含量[6]。HPLC上樣分析色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇+水（15%+85%），流速為1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫室溫，進樣量10 μL。以5-HMF標準品質量為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 黑菊芋加工中5-HMF含量變化

新鮮菊芋洗凈、切成厚度約1.5 cm左右的片，瀝干水分后，裝入耐高溫塑料袋中，每袋500 g，放入黑菊芋加工設備中啟動程序開始加工。分別于程序開始的0，4，8，12，24，72，120，168，216，264，312和360 h取樣。分析不同加工時間5-HMF含量。

1.3.4 幾種常見食品中5-HMF含量分析

分別稱取不同保存時間黑菊芋、黑蒜、嘉應子、烏酸梅，黑咖啡各1 g，以1.3.2中方法分析5-HMF含量。

1.4 數據處理

利用Excel 2007作圖，采用Graphpad Prism 5進行差異顯著性分析。p＜0.05為顯著性差異。p＞0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 5-HMF提取條件優化

由圖1～圖4可知，以濃度≥98%的5-HMF標準品繪制標準曲線，曲線方程為y=9 360.4x-7 035.7，R2= 0.999 4，隨提取溫度的升高，提取率顯著增加（p＜ 0.05），40℃達到最高，含量為0.913 8 mg/g，之后保持穩中有降趨勢（p＞0.05）。這可能是由于溫度的升高促進了5-HMF在溶劑中的擴散速度，但是當達到一定閾值時則不再升高。因此選擇35，40和45℃三個水平進行下一步正交試驗。料液比單因素試驗中，當料液比為1∶8（g/mL）時，提取率顯著高于其他幾組（p＜ 0.05），因此選擇料液比1∶7，1∶8和1∶9（g/mL）三個水平進行正交試驗。隨提取時間增加，類黑精提取率逐漸升高，4 h之后基本保持穩定狀態。因此選擇3，4和5 h三個水平進行下一步正交試驗。

圖1 5-HMF標準曲線

圖2 溫度單因素試驗

圖3 料液比單因素試驗

圖4 時間單因素試驗

由表1可知，提取溫度、料液比，時間三個因素都會影響提取效果。因此，選取以上因素進行L9(34)正交試驗。結果由表1可見，三個因素中料液比＞時間＞溫度，但R值差異不大，表明三個因素對于提取率的影響度相當。最佳條件為，A2B2C3。最優方案在試驗組中，結果為0.913 4 mg/g大于其他試驗組。因此，最佳提取條件為40℃、1∶8（g/mL）、5 h。

2.2 黑菊芋加工和保存中5-HMF含量變化

由圖5可知，5-HMF的生成是一個十分復雜的過程，在食品中主要通過兩個途徑，焦糖化反應[7]和美拉德反應[8]。這兩種應均是以己糖為反應底物的，若為二糖或多糖則先水解為單糖再發生反應。菊芋中含豐富的菊糖，黑菊芋加工中通過發生上述兩種反應能夠形成5-HMF。研究中24～264 h時5-HMF含量顯著增加（p＜0.05）與上述理論是相符的。隨著加工進行，美拉德反應進入后期，5-HMF含量呈現穩中略降的趨勢。這是由于生成了一種美拉德反應終產物類黑精。5-HMF是類黑精生成的中間產物[9]，在黑菊芋加工后期發生了轉化。由表2可見，隨保存時間加長，黑菊芋中有5-HMF含量顯著降低（p＜0.05），這是由于5-HMF自身穩定性不好，可發生聚合反應或分解為乙酰丙酸和甲酸[10]。這些原因很好的解釋了5-HMF在加工和保存中的變化趨勢。

表1 正交試驗設計

圖5 黑菊芋加工中5-HMF含量變化

表2 不同保存時間黑菊芋中5-HMF含量變化

2.3 幾種常見食品中5-HMF含量分析

5-HMF是一種呋喃類化合物，菊芋中含有的大量菊糖能夠為5-HMF的生成提供物質基礎。目前對于5-HMF的安全性仍存在爭議。有研究認為，5-HMF能夠造成DNA損傷[11]，具有潛在的致癌性[12]，能與人體蛋白質結合引起中毒，造成橫紋肌麻痹和內臟損害[13]。有學者則認為5-HMF并不存在嚴重的健康危險，Janzowski等[14]的研究，5-HMF雖然能夠使正常細胞內谷胱甘肽活性受到一定影響，但遠遠達不到給人體帶來嚴重損害的程度。近年來的藥理研究表明：5-HMF具有增強大鼠紅細胞變形活性、抗氧化、改變血液流變，保護神經遠等對人體有益的作用，作為有效成分制備抗心肌缺血的心血管病藥品，已被中國藥科大學作為專利進行申請[15]。研究分析了同種不同食品中5-HMF含量結果見表3，其中黑咖啡含量為4.949 4 mg/g顯著高于保存0～18個月黑菊芋（p＜0.05），嘉應子與烏酸梅含量分別為0.981 9及0.803 8 mg/g與保存6個月黑菊芋相當。黑蒜含量介于保存0～3個月黑菊芋之間。這一結果能夠為黑菊芋食用安全性提供佐證。另外，食用量方面，Abraham等[16]通過各種動物試驗證明了5-HMF每天攝入量在80～100 mg/kg體質量范圍內無不利影響，成人體質量按照60 kg計算，每天攝入量為4 800～6 000 mg的5-HMF不會對身體產生不利影響。折合后相當于7 433 g存放18個月的黑菊芋和5 302 g存放6個月黑菊芋中的5-HMF含量。而建議的黑菊芋食用量為成年人每天食用30～50 g。因此其食用安全性可以保證。3 結論

表3 不同食品中5-HMF含量分析

正交試驗確定黑菊芋5-HMF最佳提取條件為；40℃、料液比1∶8（g/mL）、提取時間5 h。黑菊芋加工過程中，菊芋中菊糖發生了美拉德反應，5-HMF含量呈先顯著升高后穩中有降趨勢，這是由于反應后期5-HMF轉化成了黑菊芋的呈色物質類黑精。5-HMF性質不穩定，隨保存時間加長含量逐漸降低。各保存時間含量均顯著低于黑咖啡。保存6個月后黑菊芋與嘉應子及烏酸梅等常見果脯含量相當。黑菊芋具有食用安全性，對人體不存在嚴重的健康威脅。