血管生成素樣蛋白2與高脂血癥性急性胰腺炎的相關性研究

夏亞蘭，王民開

（1.黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000；2.貴州醫科大學第三附屬醫院，貴州 都勻 558000）

高脂血癥是急性胰腺炎發病的重要原因之一，其病因復雜，可能與高脂血癥直接損傷、微循環障礙、胰蛋白酶原激活等有關[1-2]。血管生成素樣蛋白2（Angptl2）主要是在鼠肝臟特異性表達的分泌型蛋白質，參與調節脂類代謝及抑制脂蛋白酶的活性，進而升高血漿血脂水平[3]。目前，Angptl2基因高表達可能與冠心病、糖尿病、腎病、腫瘤血管形成等存在一定相關性，但尚無關于Angptl2基因與高脂血癥性胰腺炎相關性的報道[4-5]。本研究通過建立相關動物模型，探討Angptl2與高脂血癥性急性胰腺炎的相關性，為該疾病開辟新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

試劑：戊巴比妥鈉（湖北鴻運隆生物科技有限公司）、丙基硫氧嘧啶（上海麥克林生化科技有限公司）、?；悄懰徕c（美國Sigma公司）、膽酸鈉及膽固醇（上海寶曼生物科技有限公司）、吐溫-80（天津市福晨化學試劑廠）、甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）、無水乙醇（上海弗霓生物科技有限公司）、Trizol試劑（Invitrogen公司）、T0901317（上海 selleck chem 公司）、淀粉酶試劑盒（南京建成生物有限公司）、Angptl2試劑盒（美國UCL公司）。

儀器：實時熒光PCR（ABI7300）、熒光倒置顯微鏡成像系統（奧林巴斯公司）、離心機（北京奧德公司）、移液器（德國Eppendorf公司）、低溫冰箱（海爾集團）、恒溫水浴箱（上海精宏公司）。

1.2 實驗動物及分組

選取實驗動物中心提供的180只清潔級SPrague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量 160～180 g，平均體質量（169.26±0.37）g。采用隨機數字表法分為正常組（n=30）、高脂血癥組（n=30）、高脂血癥性急性胰腺炎組（n=30）、急性重癥胰腺炎組（n=30）、藥物高脂血癥組（n=30）、藥物高脂血癥性急性胰腺炎組（n=30）。所有大鼠均喂養均衡飼料，每日補充或更換飼料、飲水及墊料等。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 正常組：予以均衡飼料，術中僅翻動大鼠胰腺及十二指腸。高脂血癥組：予以高脂飼料（77%均衡飼料+20%豬油+3%膽固醇），構建高脂血癥模型，術中僅翻動大鼠胰腺及十二指腸。高脂血癥性急性胰腺炎組：予以高脂飼料，頭皮針逆行穿刺胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液，構建高脂血癥性急性胰腺炎模型。急性重癥胰腺炎組：予以均衡飼料，急性重癥胰腺炎模型構造與高脂血癥性急性胰腺炎組類似。藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組：相關模型制備如前所述，采用10 mg/kg肝X受體（LXR）激動劑T0901317灌胃，制備藥物模型[6-7]。所有大鼠均喂養2周。

1.3.2 Angptl2 mRNA及其蛋白檢測 用Trizol試劑提取大鼠肝臟組織總RNA，溶解于無Rnase的水中，取總RNA 2 μg，逆轉錄試劑盒合成cDNA。取10 μL逆轉錄產物進行PCR反應，用ΔΔCt值法，以GAPDH表達為內參照，觀察定量Angptl2 mRNA的表達。Angptl2引物序列：上游：5'-CAAGATGATCTGCCTGCTGACT-3'；下游：5'-ATGTCCGTGGAGTGCCTGA-3'；參照GAPDH引物序列上游：5'-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'；下游：5'-GGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。模型建立6 h后，大鼠心臟穿刺采血5 mL，離心機離心15 min（3 000 r/min），得血清。采用美國Eh800型BioTek酶標儀測定450 nm處光密度值，然后參考標準曲線查出相對應的血清Angptl2水平。

1.3.3 病理切片 用10%福爾馬林常規固定大鼠胰腺組織，石蠟包埋、切片。采用HE染色胰腺組織，光鏡下觀察胰腺組織情況。采用Grewal法[8]進行胰腺組織病理評分，具體如下：（1）水腫。0分：無水腫；1分：葉間隙輕度增寬；2分：葉間隙重度增寬；3分：腺泡間隙增寬；4分：細胞間隙增寬。（2）壞死。0分：無壞死；1分：壞死面積≤10%；2分：10%＜壞死面積≤20%；3分：20%＜壞死面積≤30%；4分：壞死面積＞30%。（3）炎癥。高倍鏡下，0.1分/個炎性細胞，若炎性細胞數≥30個，則計4分。（4）出血。0分：無出血；1分：出血。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件分析數據，采用F檢驗來計算Angptl2 mRNA、蛋白等計量資料平均值的差異程度，采用LSD-t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況

高脂血癥組及高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白和Angptl2 mRNA水平均高于正常組及急性重癥胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA均高于正常組、高脂血癥組、高脂血癥性急性胰腺炎組、急性重癥胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2 mRNA及Angptl2蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況（±s）

表1 各組Angptl2 mRNA及其蛋白表達情況（±s）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05

Angptl2 mRNA Angptl2蛋白（ng/mL）組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組例數30 30 30 30 30 30△△1.51±0.31 2.08±0.17 2.57±0.29 1.85±0.24 5.62±0.53 5.48±0.57 717.20<0.01△*△*#△*#&△*#&△*△*#△*#&△*#&F P--28.31±12.32 40.15±18.51 49.52±21.37 30.85±14.50 61.85±26.60 60.85±23.57 15.70<0.01

2.2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較

高脂血癥組及高脂血癥性急性胰腺炎組總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平均高于正常組及急性重癥胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組及藥物高脂血癥性急性胰腺炎組總膽固醇、甘油三酯水平均高于正常組、高脂血癥組、高脂血癥性急性胰腺炎組、急性重癥胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組總膽固醇、甘油三酯水平高于藥物高脂血癥性急性胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05）；藥物高脂血癥組淀粉酶水平低于藥物高脂血癥性急性胰腺炎組，差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較（±s）

表2 各組血清總膽固醇、甘油三酯、淀粉酶水平比較（±s）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05；與藥物高脂血癥組相比，@P<0.05

甘油三酯（mmol/L） 淀粉酶（U/L）總膽固醇（mmol/L）組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組例數30 30 30 30 30 30△△2.97±1.32 4.87±1.85 6.52±2.70 3.80±1.66 10.34±3.65 9.82±2.73 48.12<0.01△△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*#&@△*△*#△*#&△*&@F P--0.82±0.13 1.20±0.24 1.38±0.17 1.07±0.15 1.98±0.41 1.79±0.37 81.03<0.01 703.89±113.65 985.72±153.58 3 021.83±1 527.65 813.26±133.07 1 219.92±285.74 2 937.62±1 510.53 43.59<0.01

2.3 各組胰腺組織病理評分比較

高脂血癥性急性胰腺炎組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組水腫、壞死、炎癥、出血評分均高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組、藥物高脂血癥組，差異具有統計學意義（P<0.05）；高脂血癥性急性胰腺炎組與藥物高脂血癥性急性胰腺炎組水腫、壞死、炎癥、出血評分差異無統計學意義（P>0.05），見表3。高脂血癥性急性胰腺炎組可見炎性細胞浸潤、出血、壞死表現；藥物高脂血癥性急性胰腺炎組較高脂血癥性急性胰腺炎組更為嚴重，見圖1。

3 討論

3.1 高脂血癥性急性胰腺炎發病原因

高脂血癥是導致急性胰腺炎的主要病因之一，可加重急性重癥胰腺炎病理損害。相關研究表明，大鼠胰腺灌注不同濃度甘油三酯，其淀粉酶水平均升高，且灌注濃度越高，淀粉酶水平越高[9-10]。本研究通過飼喂高脂飼料及頭皮針逆行穿刺胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液，構建高脂血癥性急性胰腺炎模型，發現其淀粉酶水平高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組及藥物高脂血癥組（P＜0.05），且水腫、壞死、炎癥、出血評分也較高，鏡下胰腺組織表現更為嚴重，與國內外研究類似?？赡芘c胰脂肪酶將甘油三酯水解為游離的脂肪酸而氧化損傷腺泡細胞，促使胰酶釋放，導致胰腺損害有關[11]。此外，游離脂肪酸分解產物可激活胰蛋白酶原，促使腺泡分解，更加加重胰腺損傷[12]。目前，關于高脂血癥性急性胰腺炎的研究主要停留在臨床研究，對于其發病相關基因研究報道甚少。

表3 各組胰腺組織病理評分比較（±s，分）

表3 各組胰腺組織病理評分比較（±s，分）

注：與正常組相比，△P<0.05；與高脂血癥組相比，*P<0.05；與高脂血癥性急性胰腺炎組相比，#P<0.05；與急性重癥胰腺炎組相比，&P<0.05；與藥物高脂血癥組相比，@P<0.05

1.00±0.00 0.65±0.28 0 1.00±0.00 574.94<0.01組別正常組高脂血癥組高脂血癥性急性胰腺炎組急性重癥胰腺炎組藥物高脂血癥組藥物高脂血癥性急性胰腺炎組壞死出血例數30 30 30 30 30 30△水腫0.41±0.52 0.85±0.44 3.83±0.47 2.81±0.83 0.95±0.42 3.38±1.15 136.02<0.01 0 0△0 0△*△*#△*#&△*&@△*△*#3.65±0.53 2.27±0.42 0 3.77±1.30 285.66<0.01△*△*#△*&@△*△*#△*#&△*&@△*&@F P--炎癥0.21±0.25 0.51±0.37 3.47±0.81 2.45±0.92 0.65±0.32 3.44±0.83 164.82<0.01

圖1 胰腺組織HE染色（×400）

3.2 Angptl2升高高脂血癥性急性胰腺炎血脂水平

Angptl2可調節體內脂代謝及促進血管生成，可升高大鼠血脂水平及抑制脂肪酶活性[13]。相關研究表明，Angptl2高表達與冠心病、冠狀動脈粥樣硬化、腎病、糖尿病等存在一定相關性。本研究發現，高脂血癥性急性胰腺炎組Angptl2蛋白及Angptl2 mRNA水平均高于正常組、高脂血癥組、急性重癥胰腺炎組（P＜0.05），血清總膽固醇及甘油三酯水平均較高，表明Angptl2可升高高脂血癥性急性胰腺炎的血脂水平，可能與其具有一定相關性。

3.3 LXR激動劑T0901317上調Angptl2水平

本研究進一步每天用10 mg/kg LXR激動劑T0901317給大鼠灌胃，一周后構建藥物高脂血癥模型及藥物高脂血癥性急性胰腺炎模型，發現兩種模型的Angptl2蛋白、Angptl2 mRNA、總膽固醇、甘油三酯水平均高于其他4組（P＜0.05），可能是LXR激動劑T0901317可聚集大鼠肝臟及血漿中的甘油三酯，加速膽固醇的逆轉運，誘導Angptl2 mRNA表達，導致上述指標水平升高[14-15]。另外，藥物高脂血癥性急性胰腺炎組與高脂血癥性急性胰腺炎組淀粉酶水平及胰腺組織病理評分無明顯差異（P＞0.05），但鏡下發現藥物高脂血癥性急性胰腺炎組炎性細胞浸潤、出血、壞死表現更為嚴重，表明Angptl2可能參與了高脂血癥性急性胰腺炎的發生發展，且LXR激動劑T0901317可能上調大鼠Angptl2水平，導致胰腺組織損害更加明顯。

綜上所述，Angptl2與高脂血癥性急性胰腺炎存在一定的相關性，LXR激動劑T0901317可上調高脂血癥性急性胰腺炎大鼠Angptl2水平，加劇胰腺損傷。