重復經顱磁刺激治療腓總神經損傷的療效

劉 敏，李 嵩，王紅蓮

(1.河北醫科大學第二醫院康復科，河北 石家莊 050000；2.中國人民解放軍陸軍工程大學門診部，河北 石家莊 050000)

周圍神經損傷(peripheral nerve injury，PNI)是臨床上較為多見的創傷，每年新增創傷患者超過千萬，其中合并PNI的高達2.8%[1]，是一種常見的致殘性疾病，常見的有腓總神經損傷、臂叢神經損傷、橈神經損傷、股神經損傷等。PNI常伴神經的缺血缺氧性損傷，尤其是擠壓傷后，引起該神經支配區域早期出現運動感覺障礙，晚期出現營養(植物神經功能)障礙[2]。周圍神經與中樞神經不同，其具有損傷后神經再生的能力，肌神經纖維斷裂之后，細胞和分子生物學一系列變化在神經斷端遠側和近側纖維出現，新的突觸聯系在相應的靶器官和再生的軸突之間重新建立[3]。臨床上促進PNI后再生和修復的方法種類繁多，目前國內外主要方法是橋接神經斷端，促進神經軸突再生，克服再生屏障為神經再生提供了良好的基礎，但是神經再生的速度并不能因此而顯著加快[4]，因此怎樣使PNI后軸突的再生速度加快，是PNI修復的臨床治療研究重點。PNI后神經營養因子參與神經元再生、生長及分化，發揮其特異生物學功能，神經細胞軸索在神經損傷后中斷，可產生大量腦源性神經營養因子[5]。這些腦源性神經營養因子和神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在構成良好微環境中起重要作用，在神經損傷后單獨或協同作用保護神經元、促進軸突再生。經顱磁刺激原理是人體在磁場的作用下，受損神經組織興奮，促進神經軸突的再生，使受損神經功能恢復加速，因此可被用于PNI的治療中[6]。本實驗旨在探討重復經顱磁刺激治療兔腓總神經損傷的療效及對NGF和bFGF的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料 普通級健康雄性Sprague-Dawley新西蘭兔80只，隨機分為2組，每組40只。治療組6～8月齡，平均(7.00±0.60)月齡，體重2.0～3.0 kg，平均(2.50±0.25)kg，模型組6～8月齡，平均(7.00±0.80)月齡，體重2.10～2.90 kg，平均(2.45±0.30)kg。2組月齡、體重差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2建立腓總神經損傷動物模型 每只家兔均行右后肢腓神經鉗夾術，建立失神經模型。各實驗組家兔用3%戊巴比妥鈉溶液(1.5 mL/kg)腹腔緩慢注射麻醉，取右后肢外側鈍性分離開股二頭肌，分離出脛神經和腓總神經。腓總神經沿股二頭肌內側緣向外下方行走，后分成內、外側束，鈍性分離出家兔右側腓神經后，在分束前鉗夾腓神經，止血鉗扣滿3扣，鉗夾15 s松開，神經挫壓長度為3 mm，鉗夾后見腓神經變菲薄，將神經放回原位，神經損傷點處用9-0Nylon線標記。后逐層縫合皮膚，模型建立過程由一個人完成。

1.3免疫組織化學染色 所用試劑為鼠抗兔NGF單克隆抗體(Sigma公司)，鼠抗兔bFGF單克隆抗體(Sigma公司)，免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase,SP)試劑盒、對氨基聯苯胺顯色劑。腓神經組織在10%的中性福爾馬林溶液48 h浸泡固定，石蠟包埋，切片機做3～4 μm厚度連續切片，采用SP法進行免疫組織化學檢測。分六步進行：①無水酒精二甲苯脫蠟，酒精95%、80%、79%梯度水化；②切片用3%雙氧水5 min滅活內源性過氧化物酶活性，PBS洗2 min，2～3次；③加一抗室溫孵育60 min，PBS洗2 min，2～3次；④加過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育30min，PBS洗2 min，2～3次；⑤對氨基聯苯胺顯色6 min，顯微鏡下觀察胞漿呈棕色為陽性；⑥蘇木素復染，鹽酸酒精分化，常規脫水，透明，用中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替一抗。陽性對照使用訂購的陽性對照片。

1.4治療方法 采用武漢依瑞德CCY-ITMS治療儀，在兔頭頂正上方2 cm處放置直徑為10 cm的磁刺激線圈，應用rTMS模式，頻率為10 Hz，磁場強度為1 T。每次治療20 min，1次/d，共治療20 d。治療組家兔在手術次日開始作重復經顱磁刺激，模型組不做rTMS，但同樣置于和治療組相同的籠內。

1.5取材 造模成功1 d后開始治療，連續治療20 d后進行取材。按同樣的方法麻醉、消毒原切口分離暴露損傷側腓總神經。在距離鉗夾神經致損處1 cm遠端取2段5 mm長的腓神經組織放入10%的中性福爾馬林溶液及浸泡固定，進行石蠟包埋、染色和中性樹膠封片，免疫組化染色定量分析，同時行3～4 μm厚度半薄切片。

1.6療效評定方法

1.6.1肌電圖檢測 用日本產Keypoint 2/4型4導程肌電圖儀，刺激點位于脛前肌肌腹，檢測時室溫要求在25 ℃。測定到插入電位延長；靜息狀態出現纖顫電位；輕收縮時運動單位電位平均時限延長大于正常值的20%，波幅小于正常值的75%為異常。記錄異常只數。運動傳導速度和波幅的測定，腓神經運動傳導速度低于(58.4±6.7) m/s為減慢，波幅低于(18±8) mV為降低。

1.6.2圖像分析 每張切片經免疫組化染色后，于顯微鏡下隨機取5個部位圖像框，用HPAIS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統免疫組化測量程序(河北醫科大學病理教研室提供)進行檢測，顯微鏡下觀察細胞胞漿呈棕色為陽性，灰度值與陽性反應強度呈反比。

1.7統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1肌電圖檢測 治療前，2組插入電位延長、纖顫電位、運動單位電位指標差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，2組插入電位延長、纖顫電位指標異常只數明顯少于治療前，運動單位電位指標異常只數明顯多于治療前，差異均有統計學意義(P<0.05)。治療后，治療組插入電位延長、纖顫電位指標異常只數明顯少于模型組，運動單位電位指標異常只數明顯多于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

*P值<0.05與治療前比較(χ2檢驗)

2.2運動神經傳導速度及波幅的比較 治療前，2組運動神經傳導速度及波幅差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，2組運動神經傳導速度及波幅均高于治療前，治療組運動神經傳導速度及波幅均高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.32組受損腓神經組織NGF和bFGF的灰度值比較 治療組兔受損腓神經組織中NGF和bFGF的灰度值均明顯高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

組別運動傳導速度(m/s)治療前治療后波幅(mV)治療前治療后模型組41.12±9.5749.28±13.52*10.15±3.1915.31±5.13*治療組45.02±5.5961.52±7.15*10.10±3.1517.02±7.15*t值2.1764.3622.0312.815P值0.0980.0010.1520.037

*P值<0.05與治療前比較(配對t檢驗)

組別NGFbFGF治療組99.93±16.32105.2±19.7模型組172.38±12.77183.4±17.8t值13.17014.130P值<0.001<0.001

3 討 論

腓總神經繞行腓骨頸處位置表淺，且緊貼骨膜，周圍骨性組織堅硬，神經在狹小的空間活動，對外來傷害的躲避能力較差，在這些部位更易受到傷害[7]，很多誘因易壓迫腓總神經造成損傷麻痹如坐姿不正確、蹲位時間過長、間質性炎癥等。腓總神經為混合神經，運動纖維多，感覺纖維較少，損傷后主要引起運動功能障礙，踝背屈不能，伸趾不能，馬蹄狀內翻足等典型癥狀，還可引起不同程度的靶器官肌肉萎縮，嚴重影響患者日?；顒雍驼Ｐ凶吣芰8]。由于神經以平均每天1 mm的速度緩慢生長，再生速度極其緩慢，在重新得到神經再支配前，可能導致其支配肌肉肌萎縮，嚴重者可致終身殘疾。因此及早積極運用神經再生技術將相應的靶器官和再生軸突重新建立突觸聯系、防止肌肉失神經萎縮顯得尤為重要[9]，促進神經功能恢復是康復訓練早期的重點。

神經營養因子是調節外周和中樞神經系統神經元發育、維持和存活的細胞生長因子。NGF有神經元營養和促進突起生長雙重生物學功能，在糖尿病周圍神經病變的大鼠應用神經營養因子治療研究中，證實雪旺細胞增殖顯著、并通過對神經相關蛋白表達的調節，使神經軸索及髓鞘再生加快[10]。bFGF在PNI的神經再生中起關鍵作用，可激活神經細胞、雪旺細胞及成纖維細胞，促進神經殘端的軸突生長[11]。bFGF具有活性強、含量少的特性，可增強骨骼肌修復調整作用。bFGF在正常狀態的骨骼肌組織內檢測不到或僅微弱表達，在骨骼肌受損傷時，bFGF表達明顯增強并發揮其生物學功能促進神經功能修復，孔亞敏等[12]研究亦可證明bFGF表達增強，可以調節微環境，能夠增強受損部位骨骼肌修復，阻止或延緩骨骼肌萎縮。

經顱磁刺激技術(transcranial magenetic stimulation,TMS)是近年來新興且發展較好的治療手段，廣泛應用于神經康復領域，但在治療PNI方面報道較少。TMS原理是通電線圈產生的磁場作用于頭顱表面，感應電流會在磁場對皮層神經的作用下產生，改變神經動作電位進而影響皮層神經的興奮性[13]。依據刺激的頻率和釋放數目，將TMS分成3種模式，即單脈沖TMS、雙脈沖TMS以及重復TMS。高、低頻2種磁刺激，是依據頻率不同、強度不同及間隔、持續時間等參數不同進行分類，不同頻率的重復TMS可產生的一系列不同神經生理效應，低頻模式抑制皮層，高頻模式興奮皮層，故應在治療不同疾病選擇模式時加以注意。目前磁刺激在高頻率、高強度的時候可使興奮性突觸后總和電位增加，引起刺激部位神經元的異常興奮，此觀點被普遍認同，也為臨床治療PNI時選擇TMS參數提供重要參考價值。

局部磁刺激作用有：①神經膜去極化，形成鈣離子內流，形成鈣波，改變神經生長相關因子的轉錄調控及其受體的構型；②靶神經元細胞突觸的連接性、可塑性改變使得神經元細胞重塑能力加強，神經元細胞功能的連接修復增強；③同時使受損神經波幅變高，神經傳導速度明顯加快[14]。本實驗結果亦證實，因此經顱磁刺激除具有定向地促進周圍神經生長的作用外，還具有腦源性神經遞質水平的調節、大腦皮質的興奮性的調節及重塑神經突觸連接的調節作用。研究顯示應用免疫組織化學染色法可以提高切片質量，有利于準確測定研究指標和臨床診斷判斷[15]，本實驗應用免疫組織化學SP法對受損兔腓總神經組織進行檢測，結果顯示，經過重復TMS治療后的兔受損腓神經組織中NGF和bFGF表達明顯較模型組高，肌電圖檢查治療組受損神經波幅變高，神經傳導速度明顯加快(P<0.05)，因此腓總神經損傷患者康復治療前后進行肌電圖檢查可判斷有無神經損傷及療效。腓總神經損傷應在早期予以重復經顱磁刺激治療, 能夠加快神經損傷的恢復。