不同處理方法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與小腸黏膜下基質(zhì)復(fù)合效果的影響

張 寧，秦錫靜，朱玉林，黃向華

(1.河北省石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050011；2.湖南省常德市湘雅常德醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 常德 415000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

陰道重建術(shù)是解決無陰道患者性生活和性角色的主要方法。目前最常用的重建方法是在膀胱和直腸之間造穴并以各種不同組織襯里覆蓋創(chuàng)面重建陰道，組織襯里的選擇在很大程度上決定了手術(shù)效果。近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程襯里的構(gòu)建為陰道重建提供了新的思路。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源充足，分離培養(yǎng)方法成熟，易于培養(yǎng)，有多向分化和旁分泌功能。小腸黏膜下基質(zhì)(small intestinal submucosa，SIS)來源廣泛，制作方法相對簡單，含有多種生長因子[1]，已被用于多種組織工程，是一種比較理想的支架材料。已有研究證實，MSCs與SIS復(fù)合能促進創(chuàng)傷的修復(fù)[2]，重建食管能促進食管上皮化和肌肉再生[3]，與SIS復(fù)合后修補胃壁缺損能促進胃壁肌層的修復(fù)[4]，還可用于心血管重建[5]。研究顯示，MSCs復(fù)合SIS能促進大鼠重建陰道的修復(fù)[6-7]，但修復(fù)效果欠佳。本研究旨在優(yōu)化MSCs與SIS的復(fù)合方法，改善大鼠重建陰道的修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 雄性Sprague-Dawley大鼠，2～5周，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[實驗動物質(zhì)量合格證號1403076，許可證號 SCXY(冀) 2013-1-003]。DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)(Hyclone)，青霉素鈉(80萬U)和鏈霉素鈉(100萬U)(華北制藥)，胰蛋白酶溶液(0.25%Trypsin/1 mmol/L EDTA)(GIBICO)，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)(Sangon)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma)。

1.2SIS的制備[8]取一段新鮮的豬小腸(空腸段尤宜)，用水反復(fù)沖洗，清除小腸內(nèi)外壁黏附的物質(zhì)，褪下漿膜和肌層沿小腸的縱軸翻轉(zhuǎn)剩余的小腸，使黏膜向外，用同樣的方法褪下黏膜，沿縱軸切開成片狀。用機械方法制得的SIS依次浸泡于含100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH的溶液(pH 11～12)中16 h。含1 mol/L HCl和1 mol/L NaCl的溶液(pH 0～1)中6～8 h，含1 mol/L NaCl和10 mmol/L PBS溶液中(pH 7～7.4)16 h，PBS溶液中2 h，含0.1%過氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8 h殺菌。每次更換溶液均需用去離子水徹底沖洗干凈。長期儲存時先冷凍干燥，儲存于-80 ℃; γ射線照射，劑量25～35 kGy，使用前在室溫下用PBS溶液浸泡解凍。新鮮制備的、干燥后、復(fù)水后的SIS進行石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察。干燥的SIS行掃描電鏡觀察。

1.3大鼠MSCs的培養(yǎng) 大鼠頸椎脫臼處死后充分浸泡于75%酒精中5 min。仰臥位固定于手術(shù)臺上分離雙側(cè)脛骨、股骨，注意保持骨髓腔完整。放在盛有PBS清洗液的60 mm玻璃培養(yǎng)皿中，移入超凈臺。用PBS清洗液充分清洗數(shù)次，10 mL 75%酒精浸泡5 min，移入另一個干凈培養(yǎng)皿中，PBS清洗液充分清洗數(shù)次。剪去2側(cè)骨骺端，移入另一個盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔。以上操作均在冰上進行。獲得的細(xì)胞懸液移入離心管1 000 r/min離心5 min。棄上清，3 mL DMEM/F12 完全培養(yǎng)基重懸，70 μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補充培養(yǎng)液至5 mL，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h首次換液，之后隔日換液1次。待細(xì)胞70%～80%融合時用胰蛋白酶溶液傳代。此為第1代細(xì)胞，4～6 d即可融合，第3代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4大鼠MSCs與SIS復(fù)合條件的篩選

1.4.1大鼠MSCs與SIS復(fù)合濃度及復(fù)合時間對復(fù)合效果的影響 將SIS按96孔板培養(yǎng)孔大小剪成圓形,盡量適形后黏膜面朝上置于孔底，加DMEM/F12完全培養(yǎng)基置恒溫箱內(nèi)預(yù)濕24 h待用。第3代MSCs消化重懸于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/mL、2×106/mL、1×106/mL。分別接種于96孔板中的預(yù)濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(每個濃度12個孔)。24 h后首次換液，此后隔日換液1次。分別于復(fù)合后1,3,5,7 d取3孔用MTT法檢測細(xì)胞活性。

1.4.2大鼠MSCs與SIS復(fù)合次數(shù)對復(fù)合效果的影響 第3代MSCs消化，重懸于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/mL、2×106/mL、1×106/mL，分別接種于96孔板中的預(yù)濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(4×106/mL 12個孔，2×106/mL，1×106/mL每個濃度21個孔)。24 h后首次換液，此后隔日換液1次。復(fù)合后第2天2×106/mL，1×106/mL濃度中的9個孔以相同細(xì)胞濃度重復(fù)接種1次，分別于復(fù)合后1,3,5,7d取3孔用MTT法檢測細(xì)胞活性。

1.4.3SIS的預(yù)處理方法對復(fù)合效果的影響 將SIS按96孔板培養(yǎng)孔大小剪成圓形,盡量適形后黏膜面朝上置于孔底。新法：預(yù)濕24 h后吸凈培養(yǎng)基使SIS貼附與培養(yǎng)孔底，盡量排凈SIS與培養(yǎng)孔底之間的氣泡，將培養(yǎng)板置于超凈臺中靜置30 min，待SIS干燥，完全貼附于培養(yǎng)孔底部后再次加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基預(yù)濕24～48 h待用。舊法：加DMEM/F12完全培養(yǎng)基置恒溫箱內(nèi)預(yù)濕24 h待用。第3代MSCs融合達(dá)90%后，消化重懸于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/mL、2×106/mL。分別接種于96孔板中的預(yù)濕后小腸黏膜下層上，每孔100 μL(每個濃度，每種預(yù)濕方法3個孔)。24 h后用MTT法檢測細(xì)胞活性。

1.5光學(xué)顯微鏡 掃描電鏡觀察復(fù)合情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用兩獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SIS大體及鏡下觀察 新鮮制備的SIS為乳白色，HE染色鏡下見疏松的膠原組織，無細(xì)胞殘留(圖1A)。冷凍干燥后的SIS呈淡黃色薄膜狀，HE染色鏡下見膠原組織結(jié)構(gòu)變致密，膠原組織間無明顯空隙(圖1B)，厚度為(6.80±1.10) μm。復(fù)水后膠原組織再次呈現(xiàn)疏松結(jié)構(gòu)(圖1C)，厚度為(25.79±11.00) μm。掃描電鏡觀察見SIS漿膜面光滑，黏膜面粗糙(圖2 A,B)。

圖1新鮮(A)，冷凍干燥(B)和復(fù)水后(C) SIS(HE ×200)

圖2 掃描電鏡下觀察SIS(×1 000)

A.漿膜面；B.黏膜面

2.2不同方法對復(fù)合效果的影響

2.2.1大鼠MSCs與SIS復(fù)合濃度及復(fù)合時間對復(fù)合效果的影響 4×106/mL MSCs與SIS復(fù)合后第1天黏附率較低，復(fù)合后3 d最高，以后逐漸降低。2×106/mL MSCs與SIS復(fù)合后第1天黏附率最高，以后逐漸降低。1×106/mL MSCs與SIS復(fù)合后黏附率先下降，第5天有所回升，其后又降低(圖3)。

2.2.2大鼠MSCs與SIS復(fù)合次數(shù)對復(fù)合效果的影響 復(fù)合后同一時間，4×106/mL MSCs與SIS復(fù)合后的黏附率不及2×106/mL MSCs與SIS分2次復(fù)合后的黏附率，2×106/mL MSCs與SIS復(fù)合后的黏附率不及1×106/mL MSCs與SIS分2次復(fù)合后的黏附率。但2次復(fù)合后的黏附率并不比高濃度單次復(fù)合后1 d的黏附率高。隨時間延長各組的黏附率均降低(圖4)。

2.2.3SIS的預(yù)處理方法對復(fù)合效果的影響 2×106/mL MSCs與新法預(yù)處理的SIS復(fù)合后其黏附率高于舊法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4×106/mL MSCs新法與舊法預(yù)處理的SIS復(fù)合后其黏附率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖5。

圖3 細(xì)胞濃度和復(fù)合時間對復(fù)合效果的影響

圖4 細(xì)胞濃度和復(fù)合次數(shù)對復(fù)合效果的影響

方法4×1062×106新法1.306±0.1292.013±0.049 舊法1.415±0.0581.684±0.156 t值1.3383.481P值0.2520.025

圖5 復(fù)合MSCs后的SIS

A.標(biāo)尺=100 μm ；B.標(biāo)尺=25 μm

3 討 論

先天畸形及后天疾病均可導(dǎo)致陰道缺失，給患者帶來軀體的痛苦和巨大的精神心理壓力，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因此重建一個結(jié)構(gòu)和功能均接近生理狀態(tài)的陰道顯得尤為重要。目前最常用的重建方法是在膀胱和直腸之間造穴，并以各種不同的組織襯里覆蓋創(chuàng)面重建陰道，組織襯里的選擇在很大程度上決定了手術(shù)效果，常用的組織襯里有腹膜、皮片、皮瓣、腔黏膜、頭皮等自體組織及羊膜、胎兒皮膚等異體組織，自體組織重建陰道給患者帶來新的創(chuàng)傷且存在自體取材受限的問題，異體組織又可能感染外源性疾病，均非理想的組織襯里材料，近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展為陰道重建提供了新思路。Zhu等[9]用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，Ding等[10]用小腸黏膜下基質(zhì)作為襯里施行陰道重建術(shù)均獲得了比較滿意的結(jié)果，但是單純應(yīng)用支架組織仍有一定的弊端，如術(shù)后陰道黏膜鱗化速度較慢使患者開始性生活的時間較長等[11]。種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合能促進重建陰道各種組織成分的再生，可能構(gòu)建一個更接近生理狀態(tài)的陰道。

SIS主要由豬的小腸制備，含有多種因子，如成纖維細(xì)胞生長因子,血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β等[1]，能促進組織的修復(fù)，相容性好[12]，利于細(xì)胞的附著和生長，使其成為組織工程支架的最佳選擇，已經(jīng)應(yīng)用于多種組織的重建。本研究采用Abraham等[8]的方法制備SIS，HE染色后未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞殘留，MSCs在制備SIS上生長狀態(tài)良好，掃描電鏡下可見細(xì)胞附著在SIS表面，呈長梭形或不規(guī)則形狀。

目前用于陰道重建的種子細(xì)胞主要有陰道上皮細(xì)胞、頰黏膜上皮細(xì)胞、陰道平滑肌細(xì)胞[13-14]。雖然復(fù)合這些細(xì)胞可以促進陰道上皮和肌層再生，但是上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，不利于大量培養(yǎng)和臨床應(yīng)用。MSCs來源充足，分離培養(yǎng)方法成熟，易于培養(yǎng)，且有多向分化能力。最近研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞可向神經(jīng)細(xì)胞分化[15]，有利于神經(jīng)再生，非常適合作為種子細(xì)胞與SIS復(fù)合后重建陰道。

前期研究顯示，MSCs復(fù)合SIS能促進重建陰道的修復(fù)[6-7]，但修復(fù)效果不甚理想。局部干細(xì)胞的數(shù)量可能影響治療效果，復(fù)合條件的篩選尤為重要。MSCs與SIS復(fù)合情況主要與MSCs的復(fù)合濃度、復(fù)合時間、復(fù)合次數(shù)及SIS的預(yù)處理方法有關(guān)。關(guān)于接種密度和復(fù)合時間各文獻報道不一，細(xì)胞接種密度從2×105個/cm2[16]，5×105個/cm2[2]，8×105個/cm2[17]、1×106個/cm2[18]均有報道。復(fù)合時間有24 h者[19]、48 h者[16]，也有復(fù)合5 d[19]、1周[17]者。為了確定合理的接種密度和復(fù)合時間，本研究采用MTT法檢測了不同密度和不同復(fù)合時間后的吸光度，結(jié)果顯示，2×105個/孔(約5×105個/cm2)最適合細(xì)胞黏附。細(xì)胞密度過大可能影響細(xì)胞展開黏附，或營養(yǎng)不足影響細(xì)胞活性和黏附率。細(xì)胞密度過小雖能保證黏附但總的細(xì)胞附著數(shù)量有限。本研究還比較了復(fù)合次數(shù)對復(fù)合情況的影響，分2次復(fù)合并不比單次復(fù)合后1 d的附著率高，因此最終確定以2×105個/孔復(fù)合1 d效果最佳。由于SIS在培養(yǎng)基中復(fù)水后漂浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞接種后不能有效地覆蓋于SIS上，將SIS在培養(yǎng)基中復(fù)水24 h后吸凈培養(yǎng)基排除SIS與培養(yǎng)孔底之間的氣泡，使SIS完全貼附于培養(yǎng)孔底部，靜置干燥后SIS于培養(yǎng)孔底黏附較緊，再次添加培養(yǎng)基復(fù)水后仍能黏附于孔底，使細(xì)胞能有效地覆蓋于SIS上，利于細(xì)胞附著。2×105個/孔的MSCs與經(jīng)過處理后的SIS復(fù)合時黏附率高于單純預(yù)濕的SIS。4×105個/孔的MSCs與經(jīng)過處理后的SIS復(fù)合時黏附率低于單純預(yù)濕的SIS，進一步證實過高濃度不利于細(xì)胞附著。

本研究探討了MSCs與SIS最佳的復(fù)合方法，最終確定采用新的預(yù)濕方法，以2×106/mL的濃度與SIS復(fù)合1 d后用于移植，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。