TFCP2在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及對預后的影響

高艷飛，龔志平，李 玲，徐曉明，曹宇霏，桑梅香

(1.河北省承德市中心醫院檢驗科，河北 承德 067000；2.河北醫科大學第四醫院科研中心，河北 石家莊 050011)

食管癌是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，在組織學上可分為腺癌和鱗狀細胞癌，其中食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是主要病理類型，其病死率居惡性腫瘤的第7位[1]。然而，由于經濟情況和飲食習慣，ESCC在中國惡性腫瘤病死率中居第4位[2]。由于ESCC與廣泛的淋巴轉移和血管浸潤密切相關，因此ESCC診斷時已為晚期，其5年生存率仍較低[3]。因此深入了解ESCC進展的分子機制有利于早期診斷、確定治療策略和總體預后。轉錄因子CP2(transcriptional factor CP2,TFCP2)由位于染色體12q13(19，20)的TFCP2基因編碼[4]。TFCP2在許多細胞中表達，參與細胞周期、細胞生長發育等多種生物學過程[5]。TFCP2在多種腫瘤的發生發展過程中起重要作用[6]。本課題組前期研究表明，TFCP2直接結合于MAGE-A11的啟動子區，并以甲基化依賴的方式調控MAGE-A11在ESCC的表達[7]。而TFCP2在ESCC中的表達情況及其與臨床病理參數和預后的關系尚不明確。本研究采用免疫組織化學法檢測ESCC組織和癌旁組織中TFCP2蛋白的表達，并分析其與臨床病理參數及預后的關系。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年2月—2013年4月河北醫科大學第四醫院收治的食管癌患者80例，均為首次發病，手術前未行放療、化療和內分泌治療。獲得手術切除的ESCC組織(原發腫瘤組織)和癌旁組織(距離癌組織5 cm以上經病理檢測證實為正常的食管組織)。所有組織均包埋于石蠟中進行免疫組織化學分析。所有研究對象均為河北省及其周邊地區的漢族居民，獲取標本均獲得病人或家屬的知情同意。一(或多個)一級或二級親屬患有食管癌/賁門癌/胃癌的被定義為具有上消化道腫瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC) 家族史。臨床病理特征的信息從醫院記錄和病理診斷中獲得。

本研究經醫院倫理委員會批準通過。

1.2免疫組織化學染色及結果評價 4 μm石蠟包埋組織切片在二甲苯中脫蠟，通過分級酒精進行水合。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)沖洗切片3次，每次5 min。將這些切片在微波爐中加熱5 min，在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中修復抗原， PBS洗滌。將切片浸入0.3% H2O2中20 min，抑制內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后，切片置于正常山羊血清中常溫孵育45 min，防止非特異性免疫球蛋白結合。然后用小鼠抗TFCP2單克隆抗體(1∶200)(BD Biosciences，USA)4 ℃過夜。以正常IgG替代原抗體作為對照。試劑盒中的原液為生物素化的山羊抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素，加DAB試劑顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，光鏡觀察。免疫組織化學染色以細胞核中出現棕黃色顆粒為陽性，采用半定量積分法判斷結果，用Image J軟件對陽性細胞的表達強度進行評分：陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分， 26%～50%為2分， 51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強度分級如下:未染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分， 棕黃色為3分。將染色面積和染色強度得分進行相乘， <4分為低表達，≥4分為高表達。

1.3統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法分析ESCC患者的生存情況，Cox模型分析預后的影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ESCC組織和癌旁組織中TFCP2蛋白高表達率比較 ESCC組織中的TFCP2蛋白高表達34例(圖1)，高表達率為42.5%，癌旁組織中的TFCP2蛋白高表達6例，高表達率為7.5%。ESCC組織中的TFCP2蛋白高表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=26.133,P<0.01)。

2.2不同臨床病理參數ESCC患者TFCP2蛋白高表達率比較 臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、有遠處轉移ESCC患者TFCP2蛋白高表達率高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、無遠處轉移ESCC患者，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；不同性別、年齡、上消化道腫瘤家族史、組織學分級和腫瘤大小ESCC患者TFCP2蛋白高表達率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 免疫組織化學法檢測TFCP2蛋白在ESCC組織中的表達

A.×200;B.×400

Figure 1 Expressions of TFCP2 protein in ESCC tissues detected by immunohistochemistry

2.3TFCP2蛋白表達與ESCC患者預后的關系 TFCP2蛋白高表達的ESCC患者總生存期顯著低于TFCP2蛋白低表達的患者(圖2)。以預后(存活=0，死亡=1)為因變量，以TFCP2蛋白表達(陰性=0，陽性=1)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結轉移(無=0，有=1)和遠處轉移(無=0，有=1)為自變量進行多因素Cox模型分析，結果顯示，TFCP2蛋白表達、淋巴結轉移和遠處轉移是ESCC患者預后的影響因素。見表2。

表1 不同臨床病理參數ESCC患者TFCP2 蛋白高表達率比較Table 1 Correlations of high expression of TFCP2 in ESCC tissuses with clinciopathological features (例數，%)

表2 ESCC患者5年生存率預后因素的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors for 5 year survival in ESCC patients

圖2 ESCC患者總體生存率與TFCP2蛋白表達的Kaplan-Meier生存曲線

Figure 2 Kaplan-Meier survival curve of overall survival rate and TFCP2 expression in ESCC patients

3 討 論

長期以來，ESCC是世界上最常見的惡性腫瘤，中位生存時間<1年[8]。隨著早期診斷水平的提高和新技術的應用，5年生存率顯著提高[9]。值得注意的是，內鏡技術的應用，包括內鏡黏膜切除術、內鏡黏膜下剝離術和射頻消融術，改善了早期食管病變的預防和治療[10]。新輔助化療和放化療能提高ESCC患者的整體生存率。盡管有許多標志物與ESCC的進展有關，但臨床上尚無可靠的預后標志物[11-16]。因此，尋找新的ESCC預后標志物至關重要。

基因的表達受到嚴格且精細的調控，基因的激活或抑制在個體發育中起著重要作用。細胞的基因表達程序受表觀遺傳調控機制和序列特異性轉錄因子活性的調控。轉錄因子通過與基因啟動子區的特定序列結合，促進或抑制基因的表達。轉錄因子表達異常影響細胞的多種生物學作用。在腫瘤發生發展的過程中，轉錄因子異常表達影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉移等生物學特性。Chang等[17]報道，轉錄因子E2F8可通過CCND1/p21促進ESCC增殖。Zhao等[18]研究表明，轉錄因子LEF1可促進ESCC發展，并激活轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路。一些轉錄因子的表達與腫瘤患者的預后密切相關。如KLF5過表達與胰腺癌的不良預后相關[19]。轉錄因子F2Fs過表達和肝癌患者的預后密切相關[20]。因此，調控或降解轉錄因子的表達是腫瘤靶向治療的策略之一。

TFCP2能調節多種細胞和病毒基因的啟動子，影響細胞周期進程和細胞存活。TFCP2可以通過與Snail誘導的纖維連接蛋白啟動子結合參與上皮細胞的間質轉化，促進前列腺癌的發生發展[5]。研究表明，TFCP2通過轉錄上調骨橋蛋白、基質金屬蛋白酶9和補體因子H和纖連蛋白1等來增強肝腫瘤血管生成，促進肝細胞癌的發生發展[6]。宮頸癌人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)陽性細胞中高表達TFCP2，表明該蛋白可能參與TSG101基因啟動子的下調和HPV依賴性宮頸癌的發生[21]。TFCP2 在食管癌、肝癌、宮頸癌及結直腸癌等多種實體腫瘤中的表達明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平與腫瘤增殖水平呈正相關[6-7,21]。腫瘤中TFCP2高表達與淋巴結轉移和遠處轉移等惡性生物學行為密切相關[4-7,21]。

本研究采用免疫組織化學技術檢測TFCP2蛋白在ESCC組織的表達情況，結果發現TFCP2蛋白在ESCC組織中的高表達率為42.5%(34/80)，與TFCP2蛋白在其他腫瘤中的表達一致[22-23]。T臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、有遠處轉移ESCC患者TFCP2蛋白高表達率高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、無遠處轉移ESCC患者(P<0.05或<0.01)；不同性別、年齡、上消化道腫瘤家族史、組織學分級和腫瘤大小ESCC患者TFCP2蛋白高表達率差異無統計學意義(P>0.05)。多因素Cox模型分析結果顯示，淋巴結轉移和遠處轉移是ESCC患者預后的影響因素。這與一項研究結果相似，結直腸癌中TFCP2高表達與腫瘤大小、晚期AJCC分期和高Ki-67指數顯著相關[4]。

本研究結果提示，TFCP2蛋白陽性表達的ESCC患者總生存期顯著低于TFCP2蛋白陰性表達患者，提示TFCP2蛋白可作為ESCC預后不良的判斷指標。將TFCP2蛋白表達、淋巴轉移及遠處轉移納入Cox風險回歸模型，結果顯示TFCP2表達是ESCC患者預后的影響因素。由此考慮TFCP2可能成為ESCC患者預測預后的理想標志物。

綜上所述，TFCP2蛋白表達與ESCC發生發展、淋巴結轉移和遠處轉移有關，TFCP2蛋白高表達與ESCC患者不良預后相關，可作為臨床評價ESCC預后的指標。