腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1及Smad1表達(dá)的影響

糖尿病腎病是慢性腎病的常見(jiàn)類型，是新增維持性血液透析患者的主要病因。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/骨形態(tài)蛋白-7（BMP-7）/Smad信號(hào)通路在腎臟疾病進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]，這些細(xì)胞因子作為糖尿病腎病早期識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)、潛在治療靶點(diǎn)和判斷保護(hù)腎臟治療的療效指標(biāo)已備受關(guān)注[2，3]。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，腎炎康復(fù)片可改善糖尿病患者和糖尿病大鼠腎功能，但具體機(jī)制尚不清楚[4，5]。本研究通過(guò)觀察腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1及Smad1 表達(dá)的影響，探討腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料清潔級(jí)雄性SD 大鼠34只，6周齡，體重180～220g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK 浙20080033。腎炎康復(fù)片（天津同仁堂股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10940034）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma 公司），免疫組化H2O2-氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒、鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物工作液、兔抗大鼠BMP-7 多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠Smad1多克隆抗體、磷酸鹽緩沖液（PBS）、檸檬酸鹽緩沖液、生物素化山羊抗兔IgG（購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.2 模型制備、分組與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）10只和造模組24只。所有大鼠均禁食（不禁水）12h 后，造模組大鼠于腹腔一次性注射1% STZ 60mg/kg（以pH 4.2的0.1mol/L 檸檬酸緩沖液配制），NC組大鼠腹腔注射相當(dāng)劑量的檸檬酸緩沖液作為對(duì)照。72h 后經(jīng)大鼠尾靜脈采血測(cè)血糖（羅氏卓越型血糖儀），隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L 者視為造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組（DM組）和腎炎康復(fù)片干預(yù)組（SYK組），各12只。SYK組以腎炎康復(fù)片600mg·kg-1·d-1的劑量（溶于生理鹽水）灌胃給藥，NC組與DM組大鼠給予相當(dāng)劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)8周。

1.3 標(biāo)本收集大鼠處死前1 天用代謝籠收集大鼠24h 尿液，用于測(cè)定尿蛋白（Upro）含量。20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠后行心臟取血，收集血漿于-20℃冰箱保存待測(cè)血糖（BG）、血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。摘取大鼠腎臟，濾紙吸干血跡后，取部分腎組織置于10%甲醛溶液中固定，留作光鏡和免疫組化檢測(cè)。

1.4 腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察及腎組織BMP-7、TGF-β1、Smad1 免疫組化檢測(cè)常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成4μm 厚度切片，行HE 染色。光鏡下觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。HE 染色切片高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球區(qū)視野，采用Image-Pro Plus 6.0 病理圖像分析軟件測(cè)量腎小球平均截面積（MGA），根據(jù)公式：腎小球平均體積（MGV）=1.25×MGA3/2，計(jì)算MGV。采用SABC 法檢測(cè)腎組織BMP-7、TGF-β1、Smad1的表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿呈棕黃色著色，高倍鏡下（×400）測(cè)量腎小球BMP-7、TGF-β1、Smad1的表達(dá)，以灰度值表示，數(shù)值越小表示染色越深，陽(yáng)性強(qiáng)度越高，每組隨機(jī)測(cè)定10個(gè)腎小球區(qū)視野，以均值作為該組的結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化比較HE 染色光鏡下觀察，NC組腎小球未見(jiàn)病理改變。DM組可見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)破壞，毛細(xì)血管管壁增厚，管腔狹窄，腎小球系膜區(qū)增寬。SYK組腎小球情況較DM組有所改善，腎小球系膜區(qū)增厚程度減輕，毛細(xì)血管管壁變薄，管腔開放，見(jiàn)圖1。

圖1 光鏡下各組大鼠腎組織病理學(xué)變化（HE 染色，×400）

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)、體重、平均腎小球體積比較干預(yù)8周末DM組和SYK組大鼠均死亡2只。DM組BG、Scr、BUN、Upro、尿量、MGA、MGV均高于NC組，但體重低于NC組（P＜0.05）；SYK組Scr、BUN、Upro、尿量、MGA、MGV均明顯低于DM組（P＜0.05），但仍高于NC組（P＜0.05）；SYK組體重大于DM組、小于NC組（P＜0.05），SYK組與DM組間血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1、2。

2.3 各組大鼠BMP-7、TGF-β1、Smad1表達(dá)比較與NC組相比，DM組和SYK組大鼠腎小球BMP-7的表達(dá)明顯降低，其灰度值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TGF-β1、Smad1的表達(dá)明顯升高，其灰度值降低（P＜0.05）。與DM組比較，SYK組大鼠腎小球BMP-7 蛋白表達(dá)升高，其灰度值降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad1的表達(dá)明顯降低，其灰度值升高（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖2～4。

表1 各組大鼠體重、BG、Scr 和BUN 比較（±s）

表1 各組大鼠體重、BG、Scr 和BUN 比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，△P＜0.05

組別只數(shù) 體重（g） BG（mmol/L） Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）NC組 10 459.00±55.97 8.80±0.77 33.30±6.23 6.26±0.93 DM組 10 206.00±41.35* 28.55±3.09* 55.10±9.57* 16.48±2.66*SYK組 10 245.00±36.82*△ 26.75±3.94* 40.40±6.67*△ 11.94±1.92*△

表2 各組大鼠Upro、MGA、MGV 和尿量比較（±s）

表2 各組大鼠Upro、MGA、MGV 和尿量比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，△P＜0.05

組別只數(shù) Upro（mg/24h） MGA（×103μm2） MGV（×105μm3） 尿量（ml/24h）NC組 10 7.55±1.35 9.29±0.78 11.20±1.42 14.50±3.24 DM組 10 56.90±9.22* 13.76±0.36* 20.18±0.80* 221.00±17.13*SYK組 10 30.42±7.78*△ 11.64±1.00*△ 15.74±2.02*△ 137.00±16.02*△

表3 各組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1 和Smad1 灰度值 比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1 和Smad1 灰度值 比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，△P＜0.05

組別只數(shù) BMP-7 TGF-β1 Smad1 NC組 10 133.49±5.47 162.89±6.87 159.27±10.06 DM組 10 161.51±4.72* 128.03±8.49* 128.48±8.13*SYK組 10 146.06±1.63*△ 142.24±5.71*△ 140.98±5.15*△

圖2 各組大鼠腎組織BMP-7的表達(dá)（免疫組化，×400）

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1的表達(dá)（免疫組化，×400）

圖4 各組大鼠腎組織Smad1的表達(dá)（免疫組化，×400）

3 討論

腎炎康復(fù)片主要由白花蛇舌草、西洋參、益母草等10 余種藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、增強(qiáng)免疫、活血化瘀等功效。本研究顯示，8周末STZ 誘導(dǎo)的DM組大鼠較NC組血肌酐、尿素氮、尿蛋白顯著升高，尿量明顯增多、體重下降；腎臟病理顯示腎小球毛細(xì)血管管壁增厚，管腔狹窄，腎小球系膜區(qū)增寬，MGA 及MGV 增大。SYK組大鼠上述生化指標(biāo)均明顯改善，腎臟病理學(xué)變化明顯減輕，提示腎炎康復(fù)片對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

TGF-β1是導(dǎo)致腎臟纖維化的主要細(xì)胞因子。高糖環(huán)境下，TGF-β1和腎小球系膜細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）表達(dá)上調(diào)，且兩者相互促進(jìn)，致系膜細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)和系膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚，促進(jìn)腎小球硬化[6]。高血糖還可以通過(guò)TGF-β活化激酶1 信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)，參與糖尿病腎病的進(jìn)展[7]。BMP-7 和TGF-β1同屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族，BMP-7 是具有阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的促纖維化作用的細(xì)胞保護(hù)因子；給予外源性BMP-7 或誘導(dǎo)內(nèi)源性BMP-7 過(guò)度表達(dá)，能夠減少高血糖和TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，保護(hù)足細(xì)胞數(shù)量和完整性，抑制糖尿病大鼠腎臟纖維化進(jìn)程，改善腎功能[8，9]。

Smad是介導(dǎo)BMP-7/TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)蛋白，Smad 蛋白復(fù)合物的磷酸化（p-Smads）受BMP-7 和TGF-β1共同調(diào)節(jié)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球中Smad1 和p-Smads的表達(dá)顯著升高，Smad1 直接參與Ⅳ型膠原蛋白（Col-Ⅳ）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)調(diào)節(jié)，腎小球Smad1的表達(dá)和尿Smad1 水平與腎小球Col-Ⅳ和α-SMA的表達(dá)、系膜區(qū)基質(zhì)擴(kuò)張呈顯著正相關(guān)，而尿白蛋白和腎小球?yàn)V過(guò)率與系膜區(qū)基質(zhì)擴(kuò)張無(wú)關(guān)[3，11]，提示尿Smad1 水平較尿白蛋白可更好地作為糖尿病腎病早期診斷標(biāo)記物，也是遲發(fā)腎小球硬化的新型預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究顯示8周末DM組大鼠腎組織TGF-β1、Smad1的表達(dá)明顯高于NC組，而BMP-7的表達(dá)明顯降低，與既往研究結(jié)果相似[8，11]，提示DM組大鼠腎臟存在促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)。與DM組比較，SYK組大鼠腎組織TGF-β1、Smad1的表達(dá)明顯降低，BMP-7的表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腎炎康復(fù)片可以通過(guò)促進(jìn)BMP-7 表達(dá)和抑制TGF-β1、Smad1 表達(dá)，改善DM 大鼠腎臟促纖維化和抗纖維化細(xì)胞因子表達(dá)失衡，延緩糖尿病腎臟損害，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。