剪接因子SRSF9在肺癌中的表達(dá)量變化及意義

李夢(mèng)仙，俞建昆，溫艷萍，吳翰欣，高 凌，劉曉曉，邰文琳

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2）中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118）

肺癌作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，經(jīng)研究報(bào)道其發(fā)病率及致死率逐年攀升，均躍居惡性腫瘤的首位[1]。剪接因子（splicing factor，SF）參與調(diào)控前體mRNA（pre-mRNA）去除內(nèi)含子連接外顯子形成成熟mRNA這一過(guò)程。其中富含絲氨酸和精氨酸的SR蛋白（serine/arginine-rich protein）作為普遍的剪接因子家族，在選擇性剪接和組成性剪接過(guò)程中均扮演著重要的角色[2]。它們具有相似的結(jié)構(gòu)域，即位于氨基末端（N末端）的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域（RNA recognition motif，RRM）和位于羧基末端（C末端）含有高度磷酸化的絲氨酸和精氨酸的結(jié)構(gòu)域（arginine/serine-rich domain，RS）。SRSF9作為該剪接因子家族成員之一，研究報(bào)道其已被證明是原癌基因，并且在腦癌，結(jié)腸癌，肺癌以及皮膚癌等癌癥中都存在著癌組織較于癌旁高表達(dá)的情況[3]。有不少研究表明，SRSF9主要是通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的選擇性剪接過(guò)程來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。但SRSF9在肺癌中表達(dá)量變化差異以及作用還未有研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative Real-Time PCR，QPT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)剪接因子SRSF9在臨床肺癌樣本以及肺癌細(xì)胞系中mRNA及蛋白水平的表達(dá)量差異變化，并通過(guò)ROC曲線分析其對(duì)肺癌的診斷價(jià)值，旨在為臨床早期診斷肺癌以及患者預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 病理資料及細(xì)胞來(lái)源

本研究所用的64例臨床病理樣本均來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院2017年9月至2018年5月經(jīng)病理診斷確診為肺癌患者的組織樣品。其中男性患者36例，女性患者28例；組織學(xué)分型鱗癌12例，腺癌52例；年齡＜55歲23例，≥55歲41例；TNM分期I～I(xiàn)I期57例，III～I(xiàn)V期7例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者及家屬的知情同意。肺癌細(xì)胞A549、H1299購(gòu)自南京科佰生物有限公司；人胚肺正常二倍體細(xì)胞KMB17由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

RNAiso plus（日本Takara公司）；Prime Script TM1ST Strand cDNA Synthesis Kit（南京vazyme公司）；ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix（南京vazyme公司）；RIPA裂解緩沖液（醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室）；Anti-SRSF9抗體（Abclonal）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床肺癌樣本及肺癌細(xì)胞系中總mRNA的提取 根據(jù)病理組織大小加入適量的RNAiso plus并用勻漿機(jī)勻磨組織后分裝到容積2 mL EP離心管中；離心管中加入1/5組織裂解液體積的氯仿，劇烈的上下顛倒混勻，靜止5 min后4℃，12 000 g離心15 min；將上清轉(zhuǎn)移到新的EP離心管后加入適量氯仿，反復(fù)顛倒混勻后室溫靜置10 min，4℃，12 000 g離心10 min；棄去上清保留沉淀，加入75%的乙醇清晰沉淀，4℃，12 000 g離心5 min；棄去上清后用筆圈出沉淀，待乙醇揮發(fā)完全后加入適量的Rnase free的水溶解沉淀；測(cè)定RNA濃度后備用。肺癌細(xì)胞系總mRNA提取方法與此一致。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SRSF9mRNA水平表達(dá)量 將從臨床樣本及細(xì)胞系中提取的總mRNA均按照Vazyme去基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按照Q-PCR試劑說(shuō)明書(shū)操作來(lái)測(cè)SRSF9的相對(duì)表達(dá)量。Q-PCR反應(yīng)體系共20μL；2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2 μL，ddH2O7.2μL。正向引物序列5'-TCGGCTTCGTGTGGAGTTC-3'，反向引物序列5'-AGCTTCTCGCATGTGATCCTTC-3'；內(nèi)參基因EEF1A1的正向引物序列5'-CGTAGATTCGGGCAAGTCCAC-3'，反向引物序列5'-GTGATACCACGTTCACGCTCAG-3'。將配好的反應(yīng)體系放入熒光定量PCR儀上反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)為95℃，30 s；95℃，10 s；60 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)并且每樣品3復(fù)孔重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)并采用2-△△CT相對(duì)定量來(lái)計(jì)SRSF9的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)SRSF9蛋白水平表達(dá)量 將混有細(xì)胞的PBS液體收集在干凈的EP離心管中后離心，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊大小加入適量含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，用移液器吹打，充分裂解細(xì)胞。用BCA試劑盒來(lái)測(cè)定得到的細(xì)胞蛋白液濃度。統(tǒng)一蛋白上樣量后將變性好的蛋白液用來(lái)進(jìn)行PAGE電泳。參照蛋白Marker待目的條帶分離充分后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜采用“三明治”濕轉(zhuǎn)法（轉(zhuǎn)膜過(guò)程中小心不能出現(xiàn)氣泡）。轉(zhuǎn)膜完成后用5%的脫脂奶粉封閉1 h，根據(jù)目的及內(nèi)參蛋白大小切膜來(lái)進(jìn)行后續(xù)的免疫雜交反應(yīng)。加入提前稀釋好的SRSF9兔多克隆抗體以及GAPDH鼠單克隆抗體，4℃過(guò)夜。次日用TBST清洗PVDF膜后分別加入羊抗兔及羊抗鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h。TBST清洗膜后配制發(fā)光顯色劑，顯色觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述；兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。若不符合正態(tài)分布則用中位數(shù)以及四分位數(shù)間距描述，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較。診斷價(jià)值用ROC曲線分析；SRSF9與患者臨床病理參數(shù)之間有無(wú)相關(guān)性采用Fisher確切概率法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 剪接因子SRSF9在肺癌及癌旁組織中mRAN的表達(dá)量差異

肺癌組織中剪接因子SRSF9的表達(dá)量（3.85×10-3，2.81×10-3）高于癌旁（3.05×10-3，1.35×10-3）。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見(jiàn)圖1。

2.2 剪接因子SRSF9 mRNA水平的表達(dá)量差異

分別在人胚肺正常二倍體細(xì)胞KMB17及肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中檢測(cè)剪接因子SRSF9 mRNA的表達(dá)量（見(jiàn)圖2）。結(jié)果顯示，A549、H1299中SRSF9的表達(dá)量分別為（7.1×10-3±2.96×10-）4、（1.49×10-2±1.55×10-）3，均高于在KMB17中的表達(dá)量（5.42×10-3±5.15×10-）4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 剪接因子SRSF9在細(xì)胞系KMB17、A549、H1299中mRNA水平表達(dá)量差異圖Fig.2 The difference in mRNA expression levels of splicing factor SRSF9 in cell lines KMB17，A549，and H1299

2.3 剪接因子SRSF9蛋白水平的表達(dá)量差異

從未經(jīng)過(guò)任何處理人胚肺正常二倍體細(xì)胞KMB17、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299中提取蛋白后，通過(guò)Western blotting檢測(cè)剪接因子SRSF9蛋白水平在三株細(xì)胞系中的表達(dá)量差異（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，剪接因子SRSF9蛋白水平在肺癌細(xì)胞A549、H1299中均高于人胚肺正常二倍體細(xì)胞KMB17。

圖3 剪接因子SRSF9在細(xì)胞系KMB17、A549、H1299中蛋白水平表達(dá)量差異Fig.3 The difference in protein expression levels of splicing factor SRSF9 in cell lines KMB17，A549 and H1299

2.4 剪接因子SRSF9表達(dá)量診斷價(jià)值經(jīng)受ROC曲線分析

ROC曲線下面積為0.755，P=0.02，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。其中，診斷臨界值為3.83×10-3，相應(yīng)的靈敏度和特異度分別為0.507，0.791。

圖4 剪接因子SRSF9表達(dá)量診斷價(jià)值經(jīng)受ROC曲線分析Fig.4 The diagnostic value of SRSF9 splicing factor was analyzed by ROC curve

3 討論

近幾年流行病學(xué)研究表明肺癌由于其高發(fā)病率和高致死率已經(jīng)成為威脅人類生存的首要?dú)⑹种弧Ｓ捎谌狈υ缙谠\斷的分子標(biāo)志物，患者確診時(shí)往往已處于病程較晚階段，治療比較棘手。并且目前臨床對(duì)于腫瘤采取的治療手段主要是化療和放療，對(duì)患者副作用大且效果不甚理想[5]。隨著靶向治療以及精準(zhǔn)治療的出現(xiàn)，研究引起疾病發(fā)生的分子機(jī)制以及治療分子靶標(biāo)對(duì)于臨床診斷治療意義重大[6]。選擇性剪接是前體mRNA通過(guò)剪接因子等調(diào)控因子對(duì)剪接位點(diǎn)選擇性識(shí)別去除內(nèi)含子連接外顯子的過(guò)程。一個(gè)前體mRNA經(jīng)過(guò)選擇性剪接的調(diào)控可以形成不同的剪接異構(gòu)體，進(jìn)而翻譯出功能不同甚至相反的蛋白。這一生理過(guò)程使得真核生物在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)各種功能各異的蛋白而編碼蛋白的基因數(shù)目并沒(méi)有增多，極大的增加了基因的“豐度”。選擇性剪接在生物基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)過(guò)程中一種廣泛存在的調(diào)控機(jī)制，真核生物中有大約有90%的基因受到選擇性剪接的調(diào)控[7]。隨著對(duì)選擇性剪接研究的深入，已有不少研究報(bào)道選擇性剪接的失調(diào)與不少疾病息息相關(guān)，而其中與腫瘤的關(guān)系格外引人注意[8]。SR蛋白家族作為剪接因子的重要一類，研究其在疾病中功能異常與否對(duì)于研究選擇性剪接在疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制。不少研究[9-11]表明SR蛋白家族不同成員在多種類型腫瘤中都異常表達(dá)。例如SRSF1在結(jié)腸癌，甲狀腺癌，乳腺癌中高表達(dá)；SRSF3在卵巢癌，宮頸癌中高表達(dá)，在肝癌中低表達(dá)[12-14]。其中SRSF9已被證明在裸鼠中具有致瘤能力，即是一個(gè)原癌基因。并且其在腦癌、皮膚癌等中高表達(dá)。關(guān)于SRFS9對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能研究也有過(guò)不少研究報(bào)道。例如在宮頸癌中通過(guò)小RNA（siRNA）技術(shù)來(lái)干擾SRSF9在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)量后通過(guò)CCK-8、平板克隆等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SRSF9會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期等方面進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。在膀胱癌中對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖遷移等的影響也已經(jīng)有過(guò)報(bào)道[16]。但是SRSF9在肺癌中無(wú)論是表達(dá)量差異還是其生物學(xué)功能都還未有研究報(bào)道，所以本研究先初步通過(guò)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting來(lái)檢測(cè)SRSF9在臨床肺癌樣本以及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量差異，結(jié)合ROC曲線分析其對(duì)肺癌的診斷價(jià)值。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，SRSF9在肺癌及肺癌細(xì)胞系中都高表達(dá)，并且其對(duì)肺癌的診斷有一定的價(jià)值。提示SRSF9可能在肺癌整個(gè)疾病進(jìn)程中都高表達(dá)，可以作為肺癌的一個(gè)潛在診斷指標(biāo)。但對(duì)與其作用的分子機(jī)制并無(wú)研究并且臨床樣本量較少，所以后期應(yīng)擴(kuò)大樣本量并深入研究其在肺癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，為臨床診斷肺癌提供新的思路，肺癌治療提供新靶點(diǎn)的理論基礎(chǔ)。

并且通過(guò)本研究還發(fā)現(xiàn)雖然在肺癌細(xì)胞A549及H1299中SRSF9蛋白水平均高于KMB17，但在H1299和A549兩株細(xì)胞中表達(dá)量差異也很顯著。分析原因可能是兩株肺癌細(xì)胞之間的差別主要在于H1299細(xì)胞中P53缺陷，猜想可能是P53作為抑癌基因會(huì)抑制原癌基因SRSF9的表達(dá)。并且有研究報(bào)道過(guò)SR蛋白家族作為剪接因子的重要一員，當(dāng)其選擇性剪接功能失調(diào)時(shí)，主要會(huì)造成與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因功能異常。已有研究報(bào)道P53通過(guò)Bax/Bcl2，F(xiàn)as/Apol，IGF-BP3等蛋白來(lái)完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[17]。因此猜想P53與SRSF9之間存在著某些互作關(guān)系。本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)表達(dá)量異常這種表象，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

選擇性剪接作為生物進(jìn)程中一個(gè)重要的調(diào)控機(jī)制，極大的提高了生物物種的基因豐度，滿足了生物進(jìn)化過(guò)程中需要不斷出現(xiàn)新功能蛋白的訴求。其作用異常與人類疾病息息相關(guān)，研究明白其與疾病的關(guān)系對(duì)于人類的生命健康有著重要的意義。由于選擇性剪接作用過(guò)程復(fù)雜且參與者眾多，對(duì)于其的研究學(xué)習(xí)任重而道遠(yuǎn)。