一株刺梨葡萄汁有孢漢遜酵母的鑒定及釀酒特性分析

劉曉柱，趙湖冰，李銀鳳，于志海，劉曉輝，黃名正

(貴州理工學院，貴州 貴陽， 550003)

果酒的自然發酵是一個多菌種共同作用的復雜過程[1]。酵母菌在該過程中發揮著至關重要的作用，根據其發酵性能的差異，可將酵母菌分為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeast)兩大類[2]。釀酒酵母發酵活性強，酒精代謝旺盛，主要進行酒精發酵[3]。非釀酒酵母可合成多種酶，如蛋白酶、果膠酶、糖苷酶、纖維素酶等，并作用于果汁中相關底物，促進風味物質的釋放，在很大程度上影響果酒的色澤、風味以及復雜度[4]。常見的非釀酒酵母有假絲酵母屬 (Candida)[5]、畢赤酵母屬 (Pichia)[6]、有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)[7]、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)[8]、梅奇酵母屬 (Metschnikowia)[9]等。因此，將在非釀酒酵母與釀酒酵母進行混菌發酵果酒，有利于改善果酒品質，增加果酒風味物質的復雜性。CLEMENTE-JIMENEZ等的研究結果發現，在美極梅奇酵母 (Metschnikowiapulcherrima)與釀酒酵母共培養時，二者具有協同作用，有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多種芳香化合物的產生[10]。ANFANG將釀酒酵母和克魯維畢赤酵母(Pichiakluyveri)進行混合發酵時發現，二者按照1∶9的比例接種時，提高了長相思釀造葡萄酒中3-巰基己基乙酸鹽的濃度[11]。此外，某些季也蒙畢赤酵母(Pichiaguillermondii) 菌株具有羥基肉桂酸脫羧酶活性較強，可促進乙烯基苯酚類吡喃花青素的合成，有助于葡萄酒顏色穩定性的保持[12]。盡管近年來，國內在非釀酒酵母領域研究發展較為迅速，但目前對非釀酒酵母研究主要集中在葡萄酒領域，在其他果酒釀造中的了解還十分有限。

刺梨(Rosaroxburghii)，薔薇科、薔薇屬植物，廣泛分布于我國西南地區，其果實營養價值具有豐富的應用價值和藥用價值[13]。貴州省將刺梨作為本省重點發展的特色產業之一，近年來發展迅速，2018年全省種植面積達1 465 km2，生產總值達31.61億元。此外，貴州龍里刺梨還成為國家地理標志產品，受到國家層次的保護。但刺梨鮮果生食口感不佳，將其發酵生產為刺梨果酒是一種比較好的選擇，既保持了刺梨中豐富的營養成分，又帶動了產業發展[14]。但目前對刺梨果酒釀造酵母方面的研究還比較少，缺乏優質刺梨發酵果酒專用酵母。生產上多采用葡萄酒釀酒酵母進行發酵刺梨果酒。該類酵母發酵性能較好，但產香能力不足[15]。因此，本研究采用傳統的微生物分離技術，并結合嗅聞法，從貴州刺梨上選育出1株產香濃郁的非釀酒酵母，分析了其生理特性，將其與商業化釀酒酵母進行混菌發酵，探討其對刺梨果酒風味的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮貴農5號刺梨，采自貴州省黔南布依族苗族自治州龍里縣；YPD、WL培養基、賴氨酸固體培養基，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司;對硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG),中國上海源葉生物公司；ZYMAFLORE X16(簡稱X16)釀酒酵母，法國LAFFORT公司；其余試劑均為國產分析純，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UH5300紫外分光光度計，日本日立公司； 雷磁PHSJ-3F pH儀，上海儀電科學儀器股份有限公司,CKX41倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；SZM體視顯微鏡，中國寧波舜禹儀器有限公司；SA402B電子舌味覺系統，日本INSENT公司；Bio-rad T100TMPCR儀，美國伯樂公司；TQ8040NX氣相質譜聯用儀，日本島津儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離與鑒定

稱取100 g新鮮成熟刺梨搗碎，放入250 mL無菌錐形瓶中，密封28 ℃進行自然發酵。分別于發酵第1、 3、 5天取樣，梯度稀釋法涂布于YPD固體平板上，28 ℃，培養48 h。然后繼續挑取每個平板上的單克隆，劃線于YPD固體平板上，直至為純的單克隆為止。

挑取YPD固體平板上純的單克隆菌株，草酸銨結晶紫簡單染色，然后置于顯微鏡觀察細胞形態和生殖方式觀察。挑取YPD固體平板上單克隆菌株劃線于賴氨酸培養基上，28 ℃培養3 d，觀察其生長情況。選YPD固體平板上純的單克隆菌株劃線于WL固體培養基上28 ℃，培養5 d，觀察菌落顏色和形態。

PCR法擴增菌體26S rDNA D1/D2區域，PCR反應體系為2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L NL1引物和NL4引物各2 μL，菌液2 μL，補水至反應總體積25 μL。反應結束后取5 μL PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行BLAST同源序列搜索比對。

1.3.2 菌株生長曲線

F119菌株以106CFU/mL接種于YPD液體培養基，28 ℃、180 r/min條件下培養，每隔4 h取樣，以YPD液體培養基作為空白對照，在600 nm處測定菌懸液OD值，平行重復3次，共取樣40 h。根據時間和OD600 nm值繪制生長曲線。

1.3.3 菌株耐受性測定

糖耐受性：將菌株F119以106CFU/mL濃度接種于葡萄糖質量濃度分別為100、150、200、250、300 g/L的YPD液體培養基中，28 ℃、180 r/min條件下培養34 h，在600 nm處測定菌懸液OD值，平行重復3次。

酒精耐受性：將菌株F119以106CFU/mL接種于酒精體積分數分別為3%、6%、9%、12%、15%的YPD液體培養基， 28 ℃、180 r/min條件下培養34 h，在600 nm處測定菌懸液OD值，平行重復3次。

SO2耐受性：將菌株F119以106CFU/mL接種于SO2質量濃度分別為50、 100、 150、 200、 300 mg/L的YPD液體培養基中。28 ℃、180 r/min條件下培養34 h，在600 nm波長處測定菌懸液OD值，平行重復3次。

酸耐性[16]：將菌株F119以106CFU/mL接種于含檸檬酸酸度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的YPD液體培養基，28 ℃、180 r/min條件下培養34 h，在600 nm處測定菌懸液OD值，平行重復3次。

1.3.4 硫化氫產生能力

取10 μL 106CFU/mL的F119菌液滴加在亞硫酸鉍培養基表面上的濾紙片，待液體完全吸收后，28 ℃倒置培養5 d，觀察濾紙片變色情況。菌株產硫化氫能力由高到低，顯色情況分別為顯棕黑色、棕色、墨綠色、淡墨綠色及不顯色。

1.3.5 產β-葡萄糖苷酶能力

參考侯曉瑞等研究方法采用p-NPG法分析菌株產β-葡萄糖苷酶能力[17]。F119菌株以106CFU/mL接種于YPD培養基中，28 ℃，200 r/min培養72 h，取1 mL發酵液于離心管中，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液。取0.1 mL粗酶液與0.2 mL 35 mmol/Lp-NPG混勻，40 ℃保溫30 min，加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應，于400 nm波長處測定吸光度。酶活力單位(U)定義為pH 5.0、50 ℃條件下，1 min水解p-NPG 產生1 μmol 對硝基苯酚(p-nitrophenol，p-NP)所需酶量。

1.3.6 刺梨果酒理化指標檢測

將菌株F119和釀酒酵母X16種子液以1∶1混合接種于刺梨汁中，菌株終濃度為108CFU/mL， X16單獨發酵作為對照，每個樣本3個平行重復。25 ℃恒溫靜置培養，直至發酵結束。發酵結束后， 4 ℃、3 000 r/min離心5 min去殘渣，上清液用于后續分析。

采用蒽酮法測定刺梨果酒中總糖含量。乙酸乙酯配置15 mg/mL蒽酮溶液，0.2 mg/mL葡萄糖標準液。分別取葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，稀釋至2 mL，蒽酮試劑0.5 mL，冷水浴中加入濃H2SO45 mL，搖勻。迅速放入水浴鍋中，80 ℃下水浴15 min，取出后流動水冷卻至室溫，在620 nm處測定其吸光度。以糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。采用GB/15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法測定刺梨果酒糖含量，測定值帶入標準曲線換算為樣品中葡萄糖值，并對混合發酵刺梨果酒酒精度，總酸和揮發酸進行測定。

1.3.7 刺梨果酒感官特性測定

取發酵刺梨果酒樣品80 mL，倒入電子舌專用燒杯中。根據儀器說明書步驟進行檢測。試驗采用清洗溶液和刺梨果酒樣本交替檢測序列進行，清洗溶液為專用電極清洗液。采樣時間120 s，采樣速度為1次/s，每個樣品平行測定3次。

1.3.8 刺梨果酒揮發性香氣特性測定

參考陳思奇等[18]、蔣寶等[19]方法分析刺梨果酒香氣特性，取8 mL刺梨果酒，加入2.0 g NaCl，40 ℃水浴萃取刺梨果酒中揮發性香氣物質。GC-MS分析條件為PEG.20 m彈性石英毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，氦氣流量1 mL/min。進樣口溫度50 ℃，出樣口溫度235 ℃。離子源溫度230 ℃；四極桿溫度為150 ℃，調諧EMV 947V，質量掃描范圍為30.00～500.00 amu。NIST 14.L標準譜庫檢索并匹配GC-MS采集得到的數據，進行定性分析。采用峰面積歸一化法進行物質的定量分析。

1.4 數據分析

數據結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0進行數據單因素方差分析(ANOVA)檢驗差異顯著性,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 非釀酒酵母的篩選與鑒定

賴氨酸培養基鑒定結果表明，刺梨自然發酵液中共分離得到80株非釀酒酵母菌。采用嗅聞法篩選出1株果香和酒香味較濃的酵母菌株，命名為F119。F119菌種在WL培養基上，菌落深綠色、邊緣平整、光滑濕潤(圖1-A)；在YPD培養基上菌落黃白色、有光澤、邊緣整齊、凸起、表面濕潤(圖1-B)；菌株顯微形態為檸檬狀，出芽繁殖。結合菌落形態特點與細胞形態特征，初步認為F119為1株刺梨來源的漢遜酵母屬菌株(Hanseniasporasp.)。

A-F119在WL培養基菌落形態；B-F119在YPD培養基菌落形態；C-F119的細胞形態(100×，bar=100 μm)圖1 刺梨葡萄汁有孢漢遜酵母F119菌落與細胞形態Fig.1 Cellular and colonial morphologies of the F119 strain

PCR方法對F119 菌株26S rDNA D1/D2區域進行擴增，在約600 bp處擴增到1條特異性條帶(圖2)。擴增產物經測序和BLAST比對，發現與葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)同源性高達99.66%。因此，F119為1株來源于刺梨的葡萄汁有孢漢遜酵母。

圖2 F119菌株26S rDNA D1/D2區域PCR擴增結果Fig.2 Amplification of 26S rDNA D1/D2 domain of F119 strain

2.2 非釀酒酵母F119生長曲線

非釀酒酵母菌株F119生長曲線如圖3所示，基本上包括了延滯期、對數生長期、減速期和穩定期。其中前4 h 為延滯期，4～12 h為對數生長期，12～24 h為減速期，24 h后基本上達到穩定期。在減速期F119生長速率小于商業化的釀酒酵母X16，且減速期時間比X16長；在穩定期F119菌體濃度要低于X16。

圖3 非釀酒酵母F119生長曲線Fig.3 Growth curve of non-Saccharomyces yeast F119 strain

2.3 非釀酒酵母F119生理特性分析

菌株F119葡萄糖耐受性結果如圖4-A所示，F119可耐受0～300 g/L葡萄糖濃度，在此均可生長。從葡萄糖質量濃度250 g/L開始，菌體濃度略微降低。但0～300 g/L葡萄糖質量濃度范圍內，F119菌體濃度均低于商業化釀酒酵母X16。

菌株F119檸檬酸耐受性結果如圖4-B所示，菌株F119在酸度1%～3%均可生長，不受影響，且與商業化釀酒酵母X16之間無顯著差異，表明非釀酒酵母F119菌株具有較強的檸檬酸耐受性。

菌株F119乙醇耐受性如圖4-C所示，F119菌體濃度隨著乙醇體積分數的增大而逐漸降低，在乙醇體積分數6%時生長顯著受到抑制。在各乙醇體積分數處理下，F119菌株濃度均低于商業化釀酒酵母X16。

菌株F119 SO2耐受性結果如圖4-D所示，F119菌株在SO2質量濃度0～300 mg/L均可生長，變化較小，與商業化釀酒酵母X16之間無顯著區別，暗示F119可耐受300 mg/L SO2。

2.4 硫化氫產生能力

在酒類釀造中，菌體自溶分解可產生硫化氫。硫化氫具有臭雞蛋味，對酒體風味具有不良影響。硫化氫產生能力一般是由菌體本身遺傳背景決定的。菌株F119硫化氫產生能力如圖5-A所示，濾紙片無色，表明F119不產生硫化氫。而對照組X16濾紙片為棕色，說明具有較強的硫化氫產生能力(圖5-B)。因此，菌株F119產硫化氫產生能力要低于X16。

2.5 β-葡萄糖苷酶產生能力

以對硝基苯酚濃度為橫坐標，400 nm下的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為：y=0.130 2x+0.022 6，R2=0.999 5，吸光值與對硝基苯酚濃度之間具有較好的線性關系。p-NPG測定結果發現，F119分泌β-葡萄糖苷酶能力較低，為(13.98±0.21)mU/mL(表1)。而對照組，商業釀酒酵母X16產β-葡萄糖苷酶量為(25.41±0.06)mU/mL，為F119產酶量的1.8倍。

2.6 非釀酒酵母F119對刺梨果酒品質的影響

2.6.1 對刺梨果酒常規理化指標的影響

以商業化釀酒酵母X16純種發酵為對照，將非釀酒酵母F119與X16進行混合發酵刺梨果酒。刺梨果酒基本理化指標如表2所示，F119混合發酵刺梨果酒的pH值、乙醇體積分數、揮發酸與X16純種發酵刺梨果酒相比，無顯著區別；F119混合發酵刺梨果酒的總糖、總酸低于X16純種發酵刺梨果酒。

A-葡萄糖質量濃度；B-酸度；C-乙醇體積分數；D-SO2質量濃度圖4 非釀酒酵母F119生理耐受性Fig.4 Physiological tolerance of non-Saccharomyces yeast F119 strain注：與X16組相比較,*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

A-F119；B-X16圖5 F119硫化氫產生能力鑒定結果Fig.5 Analysis of hydrogen sulfide production ability of F119 strain

表1 p-NPG顯色法產β-葡萄糖苷酶能力測定Table 1 Determination of β-glucosidase production by p-NPG chromogenic method

2.6.2 非釀酒酵母F119對刺梨果酒感官品評的影響

采用電子舌傳感器，分析了非釀酒酵母F119對刺梨果酒感官品評的影響。結果表明，在酸味、苦味、澀味、豐富度、后味B、后味A、鮮味、咸味等滋味方面，非釀酒酵母F119、釀酒酵母X16混合發酵刺梨果酒與釀酒酵母X16純種發酵刺梨果酒之間無顯著區別(圖6)。

表2 刺梨果酒的理化指標Table 2 Physical and chemical indicators of R. roxburghii wine

注：*表示與X16組相比較差異顯著(P<0.05)(下同)

圖6 刺梨果酒滋味屬性雷達圖Fig.6 R. roxburghii wine taste attribute radar chart

2.6.3 非釀酒酵母F119對刺梨果酒香氣物質的影響

為分析非釀酒酵母F119對刺梨果酒香氣物質的影響，利用SPME-GC-MS技術測定非釀酒酵母F119與釀酒酵母X16混合發酵刺梨果酒(F119+X16)揮發性香氣物質成分。結果如表3所示，F119混合發酵刺梨果酒中共檢出40種揮發性物質成分，包括酸類4種、醇類8種、酯類17種、酮類4種、醚類2種、酚類1種、醛類1種以及烷烴類3種；對照組釀酒酵母X16純種發酵刺梨果酒中也檢測出了40種揮發性物質成分，包括酸類1種、醇類12種、酯類20種、酮類2種、醚類1種、酚類2種以及醛類2種，未檢測到烷烴類。F119混合發酵減少了刺梨果酒中醇類、酯類、酚類、醛類物質的種類，增加了酸類、酮類、醚類以及烷烴類物質的種類。

盡管F119混合發酵增加了酸類物質的種類，但酸類物質的總量相比X16純種發酵，發生了顯著降低，表明F119混合發酵在一定程度起到了降酸的作用；在醇類物質方面，F119混合發酵既減少了發酵果酒中醇類物質的種類，也降低了醇類物質的總含量，高級醇的種類和含量均減少；F119混合發酵降低了酯類物質的種類，但酯類物質總量未減少；酮類、酚類、醛類物質在F119混合發酵果酒中含量均比X16純種發酵低。

酯類物質是酒類中主要的呈香物質，具有花香和果香。2種刺梨發酵果酒中主要的酯類物質均為辛酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、2-糠酸乙酯，其在F119混合發酵刺梨果酒酯類物質中比例分別為45.15%、17.00%、12.94%、8.67%和3.44%；(9Z,12Z,15Z)-9,12,15-三烯十八酸芐酯、7-氧代二環[3.3.1]壬烷-3-甲酸甲酯、N-正己基-2,6-二異丙基氨基甲酸苯酯為F119混合發酵刺梨果酒中所特有的香氣物質，而異丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、十一酸甲酯、丁二酸(環己-2-烯基)甲基異丁基酯、5-羥基-2′,4′-二叔丁基戊酸苯酯是釀酒酵母X16發酵刺梨果酒中所特有香氣物質。

表3 刺梨果酒香氣物質種類及含量Table 3 The aroma substances and their contents in R. roxburghii wine

續表3

注，-表示無

風味活性值(odour activity value，OAV)可評價某種揮發性化合物對酒體香氣的貢獻度，OAV>1時，該化合物對酒體香氣有突出的貢獻度，反之OAV<1表明該化合物對酒體貢獻度不突出。刺梨發酵果酒中主要的揮發性化合物的OAV如表4所示。在F119混合發酵刺梨果酒中OAV>1的成分有13種，OAV<1的有3種。其中正辛醇在F119混合發酵刺梨果酒中OAV<1，在X16純種發酵果酒中OAV>1。

表4 刺梨果酒香氣成份OAVTable 4 The OAV of aroma substances in R. roxburghii wine

3 討論

由于刺梨果實本身酸、澀特性，一般以加工產品形式出售。作為貴州省主打特色產業之一，刺梨種植規模增速較快，但其加工產業發展還較為滯后，且服務于加工產業的基礎研究還比較薄弱。如對刺梨酵母研究還比較少，加工刺梨果酒的優質酵母還比較缺乏。刺梨果實上天然存在著大量的野生酵母酵母菌，其中不乏一些優質的種屬，因此從中分離優質酵母是可行的[20]。本研究采用自然發酵法對刺梨果實上非釀酒酵母進行了分離，賴氨酸培養基共鑒定出80株非釀酒酵母。嗅聞法從中發現1株產香較為濃郁菌株F119，對其進行了深入分析。生理耐受性結果發現，該菌株對葡萄糖、檸檬酸和SO2均具有一定的耐受性，且不產硫化氫。因此，對釀酒環境具有較好的耐受性。但該菌株與商業化的釀酒酵母X16相比，在乙醇耐受性，產β-葡萄糖苷酶量以及菌體生長速率等方面還有些差距。但目前微生物育種技術已發展較為成熟，可以此菌株為出發菌株，進行誘變育種，原生質體融合育種、雜交育種等技術進行相關改造，使其釀酒特性更優。

TRISTEZZA等在黑曼羅(Negroamaro)葡萄釀造過程中，將葡萄汁有孢漢遜酵母菌株ITEM8795和釀酒酵母ITEM6920以共接種和順序接種形式作為混合發酵劑[21]。結果表明，混合發酵可降低酒體中揮發酸含量，調節酒體感官特性，包括降低醇類揮發性物質的含量，增加醛酮類物質的含量。本研究中形態學與分子生物學結果表明，F119菌株為1株來源于刺梨的葡萄汁有孢漢遜酵母，將其與釀酒酵母X16以共接種的形式混合發酵刺梨果汁，可增加發酵果酒中揮發性酸性物質的種類，降低揮發性酸性物質和總酸的含量。降低醇類物質的種類和含量，增加酮類物質的種類，增加醚類和烴類物質的種類和含量。與TRISTEZZA等[21]研究結果較為相似。

混合發酵果酒中酯類物質的種類較釀酒酵母單獨發酵的少，可能與F119產β-葡萄糖苷酶能力較低相關。包括β-葡萄糖苷酶在內的糖苷酶可水解含糖苷鍵類的風味前體物質，促進揮發性風味物質的釋放[22-23]。但本研究僅分析了F119中β-葡萄糖苷酶含量，其他糖苷酶如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶[24]、α-L-吡喃鼠李糖苷酶[25]、β-D-木糖苷酶[26]活性還未知。對風味物質產生機理還需做進一步的研究。

綜上，本研究系統分析了刺梨來源的葡萄汁有孢漢遜酵母F119釀酒特性，并以此與釀酒酵母進行了混合發酵，分析了其對刺梨果酒品質的影響。結果表明，該菌株具有一定的釀酒環境耐受性，且不產硫化氫，混合發酵可調節刺梨果酒風味物質的種類和含量，因此具有一定的應用潛能。但還需要放大進行工業化的中試實驗，進一步評價該菌株特性。