槲皮素聯合CADM1對子宮內膜異位癥細胞增殖和凋亡的影響

田 金，姚 麗，蘇 敏，婁雪玲，張書偉

(1 鄭州人民醫院婦科，鄭州 450003；2 鄭州大學第三附屬醫院婦科，鄭州 450003；3 鄭州大學第一附屬醫院藥劑科，鄭州 450003)

子宮內膜異位癥是指子宮內膜組織在子宮內膜以外的部位生長、浸潤，能引起不孕、進行性痛經、月經不調等癥狀，嚴重影響女性健康和生活質量。近年來研究發現，中醫藥可改善卵巢功能異常、調節自身免疫、提高子宮內膜容受性[1-2]。槲皮素是一種天然小分子黃酮類化合物，廣泛存在于多種中草藥中，具有多種藥理作用和生物學活性，能抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲、誘導癌細胞自噬和凋亡、增強藥物及放射敏感性、逆轉耐藥性等[3]。有研究報道，槲皮素可抑制大鼠子宮內膜異位癥模型中異位內膜的生長，且與達那唑聯合治療效果更顯著[4-5]。槲皮素還可上調Caspase-9、Caspase-3，下調Bcl-2的表達，促進細胞凋亡，從而抑制異位內膜生長。細胞黏附因子1(cell adhesion molecule-1，CADM1)是CADMs家族成員之一，研究發現，CADM1在多種腫瘤細胞中具有抑制細胞增殖、黏附和轉移以及誘導腫瘤細胞凋亡的作用[6]。據報道，CADM1在子宮內膜異位癥患者組織中低表達，其可能與子宮內膜異位癥的發生、發展有關[7]。但CADM1對子宮內膜異位癥細胞增殖和凋亡的影響及其與槲皮素聯合作用對子宮內膜異位癥細胞影響尚未闡明，本研究旨在探討槲皮素和CADM1對子宮內膜異位癥細胞增殖和凋亡的影響及其聯合作用的效果是否更顯著。

1 材料與方法

1.1 細胞核試劑

子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；槲皮素購自四川省維克奇生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自Sigma公司；MTT試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司；載體、質粒均由金瑞斯生物科技公司構建。

1.2 細胞培養

子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，2天換液一次，待細胞融合至80%左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 藥物處理與分組

當細胞融合至80%左右時，將細胞傳代接種至96孔板中，用20 μg/mol的槲皮素處理End1/E6E7細胞，作為Quercetin組；未經任何處理的細胞，作為對照組(Control組)。將pcDNA-CADM1轉染至End1/E6E7細胞，記為pcDNA-CADM1組；將pcDNA-CADM1轉染至End1/E6E7細胞后用20 μg/mol的槲皮素處理，記為Quercetin+pcDNA-CADM1組，轉染均采用LipofectamineTM2000轉染試劑盒。

1.4 Western Blot檢測蛋白表達

收集各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，然后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.5 MTT法檢測細胞活力

在各組細胞培養至48 h時加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。細胞活力(%)=實驗組A值/空白對照組A值×100。每組重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細胞，離心收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加結合緩沖液重懸細胞。依據試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細胞儀檢測激發波長488 nm和發射波長530 nm處的熒光強度。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

細胞轉染72 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，然后1000 r/min離心5 min，去上清，PBS重懸洗滌2次；1000 r/min離心5 min，去上清，100 μl PBS重懸細胞，緩慢加入700 μl預冷的80%乙醇，使乙醇終質量濃度為70%，4 ℃固定24 h以上，1000 r/min離心5 min，預冷PBS洗滌2次，加入100 μl核糖核酸酶A(RNase A，50 mg/L)，37 ℃水浴30 min，加入400 μl PI(50 mg/L)，4 ℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測PI熒光強度，用Modfit軟件計算Sub G0/G1期、G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 各組子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7中CADM1的表達量

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞中CADM1的表達水平均升高；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞中CADM1的表達水平升高(P<0.05)。見圖1和表1。可見，槲皮素和過表達CADM1均可促進子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7中CADM1的表達，且槲皮素聯合CADM1效果更顯著。

圖1 Western Blot檢測End1/E6E7細胞中CADM1的表達

表1 各組End1/E6E7細胞中CADM1的表達量

與Control組比較，a：P<0.05；與Quercetin組比較，b：P<0.05；與pcDNA-CADM1組比較，c：P<0.05；下同

2.2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞增殖的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞活力均降低；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞活力降低(P<0.05)。見表2。可見，槲皮素和過表達CADM1均可抑制子宮內膜異位癥細胞增殖，且槲皮素聯合CADM1抑制效果更顯著。

表2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞增殖的影響

2.3 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞凋亡的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞凋亡率均升高，Bax表達水平均升高，Bcl-2表達水平均降低；與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組End1/E6E7細胞凋亡率升高，Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低(P<0.05)。見圖2、表3和圖3。可見，槲皮素和過表達CADM1均可促進子宮內膜異位癥細胞凋亡，且槲皮素聯合CADM1促進效果更顯著。

圖2 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞凋亡的影響

表3 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測End1/E6E7細胞中凋亡相關蛋白的表達

2.4 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞周期的影響

與Control組相比，Quercetin組和pcDNA-CADM1組Sub G0/G1期細胞比例升高，G0/G1期細胞比例降低(P<0.05)；S期和G2/M期細胞比例無顯著變化。與Quercetin組和pcDNA-CADM1組相比，Quercetin+pcDNA-CADM1組Sub G0/G1期細胞比例均升高，G0/G1期細胞比例均降低(P<0.05)；S期和G2/M期細胞比例無顯著變化。見表4。可見，槲皮素和過表達CADM1能使End1/E6E7細胞阻滯于G0/G1期，且槲皮素聯合CADM1效果更顯著。

表4 槲皮素和CADM1對End1/E6E7細胞周期的影響

3 討論

子宮內膜異位癥是一種婦科進展性疾病，發病機制復雜，且發病率呈不斷上升趨勢。近年來，中醫藥臨床治療取得良好的療效[8-9]。槲皮素是從中藥及天然植物中提取的黃酮類化合物，具有抗腫瘤細胞增殖及促腫瘤細胞凋亡的作用[10]。有研究表明，槲皮素可抑制子宮內膜異位癥細胞的增殖并誘導其凋亡[11]，可逆轉子宮內膜癌耐藥細胞株B-MD-CI(ADR+/+)細胞多藥耐藥性[12]。此外，槲皮素還能抑制宮頸癌HeLa細胞的生長及促進其凋亡[13]，并增強順鉑對HeLa細胞黏附、遷移及侵襲的抑制作用[14]。本研究結果顯示，槲皮素可抑制子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7的增殖，促進細胞凋亡；且能促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達，進一步說明槲皮素可促進子宮內膜異位癥細胞凋亡。這與前人研究結果相符，說明槲皮素具有抗腫瘤效果。

槲皮素可顯著抑制系膜細胞增殖，使系膜細胞阻滯于G0～G1期[15]；使結腸癌BIU-87細胞周期阻滯于G2/M期[16]；通過誘導P53非依賴性的G2/M細胞周期阻滯和細胞凋亡，從而實現抑制腫瘤細胞增殖的作用[17]。以上結果均表明槲皮素可通過阻滯細胞周期而抑制細胞增殖。細胞分裂都經由G1-S-G2-M期，G0/G1是細胞周期關鍵環節，通過調控G0/G1可阻止腫瘤細胞增殖。本研究結果顯示，槲皮素可增加Sub G0/G1期細胞，減少G0/G1期細胞，而S期和G2/M期細胞無顯著差異變化，說明槲皮素可能通過將細胞阻滯于G0/G1期而抑制子宮內膜異位癥細胞增殖。

CADMs家族又屬于免疫球蛋白超家族，CADM1作為CADMs家族一員可以誘導免疫細胞識別和殺傷腫瘤細胞[18]。研究發現，阻斷CADM1可以減少胰腺癌細胞晚期凋亡[19]；CADM1過表達可抑制胃癌細胞增殖和侵襲[20]，以及抑制肝癌細胞生長并負向調節G1/S轉換[21]。且有研究表明，CADM1在子宮內膜異位癥患者組織中低表達。本研究為探討CADM1對子宮內膜異位癥細胞增殖和凋亡的影響，轉染CADM1過表達載體，結果顯示，細胞活力降低，細胞凋亡率升高，Sub G0/G1期細胞增加，G0/G1期細胞減少。說明過表達CADM1可抑制子宮內膜異位癥細胞的增殖，促進細胞凋亡。

為探討槲皮素和CADM1兩者聯合作用對子宮內膜異位癥細胞增殖和凋亡的影響，本研究在轉染CADM1過表達載體的同時用槲皮素處理，結果顯示，相比單獨過表達CADM1，過表達CADM1的同時用槲皮素處理，CADM1表達水平升高，說明槲皮素可促進CADM1的表達。且相比單獨槲皮素處理或單獨過表達CADM1，過表達CADM1的同時用槲皮素處理，細胞活力降低，細胞凋亡率升高，Sub G0/G1期細胞增加，G0/G1期細胞減少。說明槲皮素聯合CADM1對子宮內膜異位癥細胞End1/E6E7的增殖抑制和凋亡促進效果更顯著，且其可能是通過調控細胞周期，促進細胞凋亡進而抑制細胞增殖的。

綜上，槲皮素和CADM1均可抑制子宮內膜異位癥細胞增殖，促進細胞凋亡，增加Sub G0/G1期細胞，減少G0/G1期細胞，且槲皮素聯合CADM1作用效果更顯著，有望為子宮內膜異位癥的治療提供新思路和新靶點。