基于均勻設(shè)計法評價柴胡提取物與芍藥苷配伍組合的抗抑郁作用

宇慶迎，劉墨林，薛玲★

（1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·國家中醫(yī)管理局重點培育學(xué)科中醫(yī)情志學(xué)學(xué)科·山東中醫(yī)藥大學(xué)情志病癥科研創(chuàng)新團隊，山東 濟南）

0 引言

抑郁癥作為一種常見的精神類疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其伴有心境低落、思維遲緩、意志活動減退、認知功能損害等臨床表現(xiàn)，對人類身心健康危害極大。據(jù)統(tǒng)計，全球有超過3 億人罹患抑郁癥[1]，約占全球總?cè)丝诘?.3%，其中中國有5400 萬患者。世衛(wèi)組織數(shù)據(jù)表明，抑郁癥病患的自殺率高達28.5%～63.7%，其中自殺死亡率為15%。由于其極高的發(fā)病率和高危害性，抑郁癥越來越受到國內(nèi)外研究者的重視[2]。

柴胡為傘形科植物柴胡 Bupleurum chinenes BC.的根 ，味苦、微辛，性平 ，具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效。白芍為毛茛科植物白芍Paeonialactiflora Pall.的去皮干燥根，性微寒，味苦、酸，歸肝、脾經(jīng)。具平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗之功效。常用于治療抑郁癥的柴芍方劑有柴芍六君子湯[3]、丹梔逍遙散[4]、四逆散[5]及柴胡疏肝散[6]等。《太平惠民和劑局方》中的逍遙散，是中醫(yī)藥治療抑郁情緒的經(jīng)典組方之一，其中柴胡、白芍為君藥[7]。柴胡功善條達肝氣，疏肝解郁，升舉陽氣，具輕清上升，宣透疏達之性，可治情志抑郁等癥；白芍酸斂肝陰，平抑肝陽，可治血虛肝郁，肝陽偏亢等癥[8]；白芍酸斂可制柴胡辛散，柴胡辛散又可佐白芍酸斂，兩者配伍協(xié)同而促進，善于疏肝止痛，治療肝郁氣滯諸癥，行之有據(jù)[9]。

柴胡提取物及芍藥苷分別為柴胡及白芍主要活性成分，現(xiàn)代研究表明柴胡提取物、芍藥苷均具有抗抑郁功效，為兩藥的配伍提供了理論依據(jù)，鑒于藥效與配比的密切關(guān)系，本文采用均勻設(shè)計優(yōu)選柴胡提取物與芍藥苷的配伍比例，并通過小鼠進行驗證實驗，得到二者的最佳配伍劑量，為抗抑郁藥物的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

YP2001N 電子天平（上海菁海儀器有限公司），SuperFst 動物視頻分析系統(tǒng)，強迫游泳桶（上海欣軟信息科技有限公司），SuperTst 動物視頻分析系統(tǒng)，懸尾實驗箱（上海欣軟信息科技有限公司），SuperMaze 動物視頻分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），曠場實驗箱（上海欣軟信息科技有限公司），分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），一次性使用無菌注射器（河南曙光匯知康生物科技股份有限公司），溫度計，壓敏膠帶（青島海諾生物工程有限公司）。

柴胡藥材購自山西，批號18060201，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurumchinense的干燥根；芍藥苷（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，相當于白芍生藥量0.04 g·g-1，含量為50%）；鹽酸氟西汀膠囊 （蘇州中化藥品工業(yè)有限公司，批號53515001）；實驗用水均為純水。

SPF 級雄性KM 小鼠，體質(zhì)量18～22g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK（京）2016-0006。本文涉及的動物實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物的制備

取柴胡飲片適量，加5 倍量95%乙醇提取2h，過濾，減壓回收乙醇至生藥質(zhì)量濃度1g·mL-1，得柴胡提取物。

2.2 統(tǒng)計學(xué)分析

2.3 柴胡皂苷與芍藥苷的配方優(yōu)選

2.3.1 均勻試驗設(shè)計

選擇柴胡提取物、芍藥苷劑量為考察因素，每個因素各設(shè)5 個水平，按均勻設(shè)計U5（25）及其使用表進行安排，共得5 種配比，見表1。柴胡和白芍依據(jù)2015 年版《中國藥典》用量范圍，折算成小鼠給藥劑量為2.28g·Kg-1、1.82g·Kg-1。

表1 柴胡提取物與芍藥苷配伍的均勻設(shè)計劑量

取健康KM 小鼠70 只，按體質(zhì)量隨機分為空白組、氟西汀組和5 個劑量組（按表1 相應(yīng)劑量）。空白組灌胃等體積純水，其余各組正常灌胃給藥，1d/ 次，連續(xù)5d，于末次給藥0.5h 后，進行曠場實驗和強迫游泳實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與給藥前相比，氟西汀組小鼠曠場中央?yún)^(qū)時間延長（P＜0.05）、強迫游泳懸浮不動時間降低（P＜0.05）；配伍3 組小鼠礦場中央?yún)^(qū)停留時間延長（P＜0.05）；配伍4、5 組小鼠強迫游泳懸浮不動時間降低（P＜0.05）。

表2 不同配比柴胡提取物與芍藥苷對小鼠曠場中央?yún)^(qū)停留時間的影響（，n=10）

表2 不同配比柴胡提取物與芍藥苷對小鼠曠場中央?yún)^(qū)停留時間的影響（，n=10）

注：與給藥前比較*P＜0.05。

組別 給藥前/s 給藥后/s空白組 183.8±453.8 631.6±1948陽性組 -21.86±553.8 344.7±1446*配伍1 146.5±1184 -15.06±2471配伍2 -245.0±881.2 -66.31±1243配伍3 -47.96±332.1 40.95±1930*配伍4 159.1±508.5 -147.0±1453配伍5 271.1±1449 524.0±1796

表3 不同配比柴胡提取物與芍藥苷對小鼠強迫游泳懸浮不動時間的 影響（，n=10）

表3 不同配比柴胡提取物與芍藥苷對小鼠強迫游泳懸浮不動時間的 影響（，n=10）

注：與給藥前比較*P＜0.05。

組別 給藥前/s 給藥后/s空白 81.48 ± 166.4 34.05 ± 136.6陽性組 108.9 ± 224.0 20.17 ± 146.9*配伍1 80.92 ± 279.9 28.67 ± 170.2配伍2 71.02 ± 247.3 52.71 ± 150.2配伍3 87.24 ± 254.4 46.71 ± 180.3配伍4 129.5 ± 220.9 37.81 ± 170.2*配伍5 88.27± 234.5 -6.002 ± 126.4*

2.3.2 柴胡提取物與芍藥苷配伍篩選結(jié)果的統(tǒng)計分析

通過SPSS Statistics 22 軟件將均勻設(shè)計的結(jié)果進行多元回歸分析，求得多元回歸方程，分別以柴胡提取物劑量、芍藥苷劑量為自變量x1 和x2，小鼠強迫游泳懸浮不動時間給藥前后差值為因變量y1，得擬合方程y1=59.98+0.26x1+0.98x2；當x1 為9.1g·Kg-1， x2 為0.3 g·Kg-1，預(yù)期藥效最佳。強迫游泳懸浮不動時間給藥前后差值隨柴胡提取物和芍藥苷劑量增加而增加，確定柴胡提取物、芍藥苷劑量分別為9.1、0.3g·Kg-1，兩者配比30.33：1 為最優(yōu)比例。設(shè)柴胡提取物+芍藥苷高劑量組（18.2+0.6 g·Kg-1），柴胡提取物+芍藥苷中劑量組（9.1+0.3 g·Kg-1），柴胡提取物+芍藥苷低劑量組（4.55+0.15 g·Kg-1）3 組及氟西汀組（0.002 g·Kg-1），空白組（等體積純水）進行驗證實驗。

2.4 優(yōu)化配比下小鼠行為學(xué)實驗

取KM 雄性小鼠50 只，按體質(zhì)量隨機分為5 組，即空白組、氟西汀組，柴胡提取物+芍藥苷高組、柴胡提取物+芍藥苷中組、柴胡提取物+芍藥苷低組，每組10 只，空白組灌胃等體積純水，其余各組正常灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)5d。于末次給藥0.5h 后，進行曠場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗，結(jié)果見表4、5、6。

表4 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠曠場中央?yún)^(qū)停留時間的 影響（，n=10）

表4 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠曠場中央?yún)^(qū)停留時間的 影響（，n=10）

注：與給藥前比較*P＜0.05。

中央?yún)^(qū)停留時間（給藥后/s）空白組 - 9.98±20.06 7.92±6.57陽性藥組 0.002 4.92±4.27 9.97±3.83柴芍高組 18.2+0.6 2.97±2.11 7.64±4.16柴芍中組 9.1+0.3 5.39±3.11 9.36±3.33*柴芍低組 4.55+0.15 5.60±2.34 2.91±2.78組別 劑量(g/Kg) 中央?yún)^(qū)停留時間（給藥前/s）

由表4 可知，與給藥前相比，柴胡提取物+芍藥苷中劑量組曠場中央?yún)^(qū)停留時間延長（P＜0.05）。

表5 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠懸尾不動時間 的影響（，n=10）

表5 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠懸尾不動時間 的影響（，n=10）

注：與給藥前比較*P＜0.05。

懸尾不動時間（給藥后/s）空白組 等體積水 124.67±44.66 167.42±59.35陽性藥組 0.002 110.93±26.38 148.35±42.48*柴芍高組 18.2+0.6 147.83±36.75 91.81±62.84*柴芍中組 9.1+0.3 164.78±38.64 139.24±34.50*柴芍低組 4.55+0.15 152.77±47.49 104.14±51.53組別 劑量（g/Kg） 懸尾不動時間（給藥前/s）

由表5 可知，與給藥前相比，柴胡提取物+芍藥苷高劑量組、柴胡提取物+芍藥苷中劑量組懸尾不動時間降低（P＜0.05）。

表6 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠強迫游泳懸浮不動時間的影響（，n=10）

表6 不同劑量的柴胡提取物與芍藥苷對小鼠強迫游泳懸浮不動時間的影響（，n=10）

注：與給藥前比較*P＜0.05，**P＜0.01。

懸浮不動時間（給藥后/s）空白組 等體積水 224.75±71.48 178.62±57.51陽性藥組 0.002 230.97±36.02 167.87±64.16*柴芍高組 18.2+0.6 243.54±41.48 170.03±69.44*柴芍中組 9.1+0.3 247.50±41.71 168.84±65.65**柴芍低組 4.55+0.15 224.55±45.48 169.51±62.64*組別 劑量（g/Kg） 懸浮不動時間（給藥前/s）

由表6 可知，與給藥前相比，陽性藥組、柴胡提取物+芍藥苷低劑量組強迫游泳懸浮不動時間降低（P＜0.05）；柴胡提取物+芍藥苷高劑量組、柴胡提取物+芍藥苷中劑量組強迫游泳懸浮不動時間顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

本文基于均勻設(shè)計的配比優(yōu)化方法，以小鼠評價柴胡提取物和芍藥苷不同配比、劑量下的抗抑郁作用，確定了柴胡提取物與芍藥苷的最佳配伍比例。

本文研究結(jié)果表明，在柴胡0～9.10g·kg-1（等效于 2015 年版《中國藥典》柴胡用量）和芍藥苷0～0.3g·kg-1（等效于《中國藥典》白芍用量）劑量內(nèi)，兩藥合用對小鼠血強迫游泳懸浮不動時間給藥前后差值的影響作用隨著柴胡提取物和芍藥苷劑量的增加而增加。確定柴胡提取物與芍藥苷比例為30.33：1，柴芍提取物劑量9.10g·kg-1，雜色蛤提取物劑量0.3g·kg-1。驗證試驗結(jié)果表明柴胡提取物與芍藥苷在最佳配伍比例下，可顯著延長小鼠的曠場中央?yún)^(qū)停留時間、降低懸尾不動時間以及強迫游泳懸浮不動時間，柴胡提取物與芍藥苷配伍具有較好的抗抑郁作用，且兩者合用的抗抑郁作用優(yōu)于單用柴胡提取物或單用芍藥苷。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇，其病位在肝，主要病機為情志所傷，肝失條達，故精神抑郁，情緒不寧。柴胡辛、苦、微寒，能疏泄肝氣，升陽舉陷。白芍苦、酸、性微寒，能養(yǎng)肝柔肝，斂陰止痛。二種藥物一起使用起到疏肝解郁，解表斂陰，清膽止痛的作用。本文將柴胡提取物與芍藥苷進行配伍，發(fā)揮協(xié)同增效的作用，為柴胡與白芍配伍的抗抑郁產(chǎn)品開發(fā)提供了實驗依據(jù)。后續(xù)可圍繞柴胡與白芍的抗抑郁作用特點深入開展其抗抑郁機制的研究。