正交設計優選金銀花超聲提取工藝

張延鵬 都昌樂 楊寧

摘 要：本文以正交設計優選金銀花總黃酮的超聲提取工藝。試驗以金銀花總黃酮為考察指標，在單因素實驗基礎上，采用L9（34）正交試驗設計，對料液比、超聲功率、超聲次數、乙醇濃度4個參數條件進行優化，以分光光度法測定金銀花總黃酮含量，得出最佳提取工藝參數。單因素考察結果顯示，超聲次數在120次、料液比為1∶40、超聲功率為120W、乙醇濃度為50%時，出現極值或最值。正交試驗結果表明：4因素對總黃酮提取率影響大小依次為超聲次數>料液比>乙醇濃度>超聲功率。由此可以得出，超聲提取金銀花總黃酮的最佳工藝條件為料液比為1∶30，超聲功率為120W，超聲次數為120次，乙醇濃度為50%。以超聲法提取金銀花總黃酮操作簡易，提取率高，適合工業生產。

關鍵詞：金銀花;總黃酮;超聲提取;正交設計

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430007

金銀花（Lonicera japonica Thunb），是忍冬科植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花[1]。因其能夠疏散風熱、清熱解毒，故臨床常用于風熱感冒、熱毒瘡癰、咽喉腫痛等癥的治療，效果良好。金銀花含有黃酮類[2，3]、揮發油類[4]、有機酸類[5]等多種化學成分。現代藥理研究表明，黃酮類化合物具有保護心肌、降血壓、提高免疫功能、抗腫瘤等多重效用[6]。目前，對于金銀花總黃酮的研究也在不斷深入，研究發現金銀花總黃酮在抑菌[7]、抗氧化[8]及保護肝臟[9，10]等方面效果良好，是金銀花的主要活性成分。金銀花總黃酮的提取方法較多，包括超臨界CO2萃取法[11]、超聲提取法[12]、溶劑提取法[13]、微波提取法[14]等，其中超聲提取法具有操作簡單、消耗時間少、溶劑用量少等優點，節能環保，適合金銀花總黃酮的提取及其工業化生產。鑒于此，本文擬采用超聲法提取金銀花總黃酮，在單因素考察的基礎上進行正交試驗，以期得到最佳提取工藝，為金銀花總黃酮的高效提取利用及后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紫外-可見分光光度計（美國BECKMAN）;超聲破碎儀（江蘇天翎公司）;電熱恒溫水浴鍋（上海一恒公司）;萬分之一電子天平（天津智博聯公司）;恒溫干燥箱（上海益恒公司）;金銀花（亳州眾益堂中藥材公司，干燥備用）;蘆丁對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201811，供含量測定用）;氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、甲醇、乙醇等均為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁對照品儲備液的配制

精密稱取蘆丁對照品10mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入60%甲醇振蕩并水浴加熱溶解，再以60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到1μg/μL的蘆丁對照品儲備液。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制備

精密吸取對照品儲備液150μL、200μL、250μL、350μL、450μL、550μL、650μL于10mL容量瓶中，各加水至1mL。再加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，靜置6min;加4%氫氧化鈉溶液4mL，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min。分別制成15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、35μg/mL、45μg/mL、55μg/mL、65μg/mL的蘆丁對照品溶液。以0μg/mL為空白對照液，于510nm波長處測定各濃度蘆丁對照品溶液的吸光度，以濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得標準曲線方程。

1.2.3 總黃酮的提取及含量測定

稱取干燥金銀花1.00g于干燥錐形瓶中，按單因素考察和正交試驗設計各參數，設定超聲次數、超聲功率、料液比及乙醇濃度進行提取。提取液經補重后過濾，取續濾液。移取續濾液1mL至10mL容量瓶中，以水稀釋至刻度;取稀釋液1mL至10mL容量瓶中，按“1.2.2”下同法顯色，取稀釋液1mL至10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，作參比[15]，于510nm波長處測定供試品溶液的吸光度，據回歸方程計算黃酮得率：

總黃酮提取率Y（%）=C×V×NM×1000×100%

式中，C指提取液中總黃酮的質量濃度（μg/mL），V指的是提取液的體積（mL），M為金銀花的質量（g），N為稀釋倍數[16]。

1.2.4 單因素考察設計

超聲提取總黃酮影響較大的因素有料液比、超聲功率、超聲次數（時間）、乙醇濃度等，對上述4因素進行單因素考察，具體如下。

1.2.4.1 料液比對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內，設置超聲時間參數（超聲工作3s、間隔5s），以乙醇濃度為60%、超聲功率100W分別在料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70下工作100次（合超聲時間300s），分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.2 超聲次數（時間）對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內，設置超聲時間參數（超聲工作3s、間隔5s），以乙醇濃度為60%、超聲功率100W、料液比為1∶40下分別工作40、60、80、100、120次，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內，其它條件一致（料液比1∶40、乙醇濃度50%、超聲工作100次），用40、60、80、100、120W的超聲功率進行提取，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.4.4 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

稱取干燥金銀花1.00g于錐形瓶內，其它條件一致（料液比1∶40、超聲功率100W、超聲工作100次），用乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%進行提取，分別測定吸光度并計算黃酮得率。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素考察的基礎上，進行4因素3水平L9（34）的正交試驗，每組制備3個樣品待測，并對最優組合進行驗證，以期優化超聲提取金銀花總黃酮的工藝條件（實驗因素水平及編碼設計見表1）。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線繪制結果

根據“1.2.2”實驗結果，以吸光度（A）為縱坐標，濃度（C，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程A=0.0123C-0.0082（R2=0.9995，n=7）（見圖1）。表明蘆丁對照品在15～65μg/mL范圍內吸光度呈良好的線性關系。

2.2 單因素考察試驗結果

2.2.1 料液比對總黃酮得率的影響

料液比影響如圖2所示。隨著液體量的變化，金銀花總黃酮提取率受到顯著影響。由圖2可知，當料液比為1∶40時黃酮得率最大，料液比超過1∶40后，黃酮得率在下降，可能是由于液體量過大致使超聲的空化效應減弱，對金銀花細胞的破碎受限，造成黃酮溶出減少。

2.2.2 超聲次數（時間）對總黃酮得率的影響

超聲次數影響如圖3所示。在超聲次數為40～120次即超聲時間為120～360s時，隨著超聲時間的延長金銀花總黃酮提取率在不斷升高，當超聲次數超過100次時曲線變化不明顯，可能是長時間的超聲波熱效應及機械效應對黃酮的結構產生了破壞。

2.2.3 超聲功率對總黃酮得率的影響

超聲功率影響如圖4所示。隨著超聲功率的增加，總黃酮提取率也在不斷上升，功率在40～80W坡線較陡，增長較快，可能因為隨著功率的增加，空化效應增強，使得金銀花細胞破碎量增多，總黃酮的析出量增大。功率高于80W之后，雖然提取率還在增加，但是趨勢逐漸平緩，隨著超聲功率的逐漸升高，可能會破壞總黃酮結構。另外，還可能使得金銀花中其它雜質的析出增多，造成有效成分不易提純。故選120W為最佳。

2.2.4 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

乙醇濃度影響如圖5所示。由圖5可知，當乙醇濃度為50%時黃酮得率最大，超過50%后黃酮得率減小，可能是高濃度的乙醇限制了黃酮類化合物的溶出，致使其被阻隔在了細胞內。

2.3 正交試驗結果

由表2分析可知，極差最大的因素是超聲次數，其次是料液比和超聲功率，極差最小的是乙醇濃度，表明影響金銀花總黃酮得率的主次因素為超聲次數>料液比>超聲功率>乙醇濃度。由各因素水平可得最優組合為A1B2C3D3，即在料液比為1∶30、乙醇濃度為50%、超聲功率為120W條件下超聲120次，測得此組合實驗金銀花總黃酮的提取率為18.83%。

3 討論

現代藥理研究明確金銀花在多種疾病的預防和治療方面卓有成效[17]，提高金銀花中有效成分的提取率可以為金銀花資源的高效可持續利用提供有力保障。本實驗采用超聲提取法并正交設計優選出金銀花總黃酮的提取工藝參數，利用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量，優化組合的總黃酮得率高達18.83%，相較于其它提取方法[11，12，18，19]有顯著提高。傳統的加熱回流提取工藝溫度過高，會破壞黃酮結構，使有效成分的穩定性降低。本法操作簡單，污染小，節約資源，經濟方便，可應用于工業生產，同時也為金銀花資源的高效開發利用提供參考依據。有學者創新性地提出通過靜電場來加強超聲波的空化效應[20]，以期達到提高有效成分提取率的目的，此舉也為中藥材資源的高效開發利用提供了新思路。

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（責任編輯 李媛媛）