刺芫荽總黃酮超聲提取工藝及抗氧化活性研究

劉芯宇，周昱彤，趙婷，溫道健，翟銳銳，姚瑰瑋，艾朝輝

（海南醫學院藥學院，海南 海口 571199）

刺芫荽（Eryngium foetidum L）. 又稱刺芹、洋芫荽、野芫荽、假芫荽、大葉芫荽、緬芫荽、阿佤芫荽等，為傘形科刺芹屬多年生草本植物，目前在世界范圍內主要分布于拉丁美洲、東南亞和非洲等地區[1]，在中國主要分布于海南、廣東、廣西、云南等熱帶或亞熱帶地區[2，3]。刺芫荽通常以全草入藥，可用于治療感冒寒咳、哮喘、胃氣痛、產后出血、跌打損傷、腸炎腹瀉、消化不良、胸痛、麻疹內陷、氣管炎、急性傳染性肝炎、蛇咬傷等癥[4～7]。

黃酮類化合物對多種腫瘤具有預防、治療或化療增敏作用，還具有降血糖、降血脂、降壓、鎮痛和抗炎作用[8，9]。若將總黃酮含量較高的刺芫荽只作為香料佐料使用，無疑是一種資源的巨大浪費。林華銘等[6]用乙醇回流提取法對刺芫荽總黃酮提取工藝進行了研究，提取黃酮的時間為1.5 h，試驗耗時比較長。超聲波輔助法提取黃酮是利用超聲波不斷振蕩提取液，破壞細胞和細胞膜結構，增強細胞內物質通過細胞膜的透過率，有利于提取物的釋放，與其他提取方法相比具有省時、高效、雜質少等優點[10～15]。但截至目前，用超聲波輔助法提取刺芫荽中總黃酮的研究尚未見報道。近年來黃酮清除自由基的抗氧化劑研究引起了人們的關注，黃酮類化合物一直是人們關注的天然抗氧化劑之一[16～21]。目前，尚未見到有關刺芫荽總黃酮提取物抗氧化活性研究的報道。

鑒于此，利用超聲輔助法提取刺芫荽中的總黃酮，通過單因素試驗篩選工藝因素的適宜水平，再利用正交試驗對提取工藝條件進行優化；并通過分析對羥基自由基（·OH） 和DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼） 自由基的清除效果以及抗油脂過氧化能力，對刺芫荽總黃酮提取物的體外抗氧化活性進行評價，旨為合理開發刺芫荽資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材 刺芫荽：采摘于海南，經鑒定為刺芫荽全草，40 ℃烘干后粉碎至40～60 目，備用。玉米油、大豆油：購于超市。

1.1.2 儀器 粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；分析天平：瑞士METILER；752 型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DK-S26 水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；RE-52 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III） 循環水真空泵：鄭州長城科工貿有限公司。

1.1.3 試劑 蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所，純度≥99%；Vc、氯仿、冰醋酸、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、無水乙醇、碘化鉀、磷酸緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH 等：均為分析純，廣州化學試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 刺芫荽總黃酮的提取工藝 取刺芫荽粉末，加入乙醇溶劑，控制超聲波水浴溫度和超聲時間，進行總黃酮的提取。

1.2.2 刺芫荽總黃酮得率的測定

1.2.2.1 標準曲線制作。精密稱取蘆丁標準品32 mg，加入體積分數60%的乙醇溶解并定容至100 mL，配成0.32 mg/mL 的標準儲備液，搖勻，備用。

分別取蘆丁標準儲備液0（空白）、1.00、2.00、3.00、4.00 和5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，制成濃度分 別 為0、0.012 8、0.025 6、0.038 4、0.051 2 和0.064 0 mg/mL 的蘆丁標準溶液。加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10 mL；用60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。用分光光度計在波長510 nm 處測定吸光度。以溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2.2 總黃酮含量測定。精密稱取刺芫荽粉末1.0 g，加入60%乙醇溶劑20 mL 浸泡過夜；在超聲波水浴溫度60 ℃條件下，超聲提取20 min；將提取液過濾，并置于50 mL 容量瓶中，用乙醇溶劑定容至刻度。移取該溶液5 mL 于25 mL 容量瓶中，加入顯色劑顯色，用分光光度計在波長510 nm 處測定吸光度。根據溶液濃度—吸光度標準曲線，得到總黃酮含量。根據公式，計算刺芫荽中的總黃酮得率：

總黃酮得率（%） =刺芫荽黃酮含量∕刺芫荽重量×100%

1.2.3 刺芫荽總黃酮超聲提取工藝條件的優化

1.2.3.1 單因素試驗[10～15]。考察因素為乙醇濃度、提取時間、料液比（mL/g）、提取溫度。改變其中1 個因素的水平，固定其他3 個因素水平，進行刺芫荽總黃酮的提取。分析單因素不同水平對刺芫荽總黃酮得率的影響，根據總黃酮得率篩選某個因素的適宜水平。每處理均3 次重復。

（1） 乙醇濃度對刺芫荽總黃酮得率的影響。準確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗乙醇濃度設40%、50%、60%、70%、80%計5 個處理，固定因素為料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、提取時間30 min。

（2） 提取溫度對刺芫荽總黃酮得率的影響。準確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗超聲溫度設40、50、60、70、80 ℃計5 個處理，固定因素為乙醇濃度60%、料液比1∶20、提取時間30 min。

（3） 料液比對刺芫荽總黃酮得率的影響。準確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗料液比設1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30 計5 個處理，固定因素為乙醇濃度60%、超聲溫度60 ℃、提取時間30 min。

（4） 提取時間對刺芫荽總黃酮得率的影響。準確稱取5 份刺芫荽粉末，試驗提取時間設10、20、30、40、50 min 計5 個處理，固定因素為乙醇濃度60%、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃。

1.2.3.2 正交試驗。根據單因素試驗結果，采用乙醇濃度（因素A）、料液比（因素B）、提取時間（因素C）、超聲溫度（因素D） 四因素三水平的正交試驗設計進行刺芫荽總黃酮的提取，確定最佳提取工藝條件。選用優化后的工藝條件提取刺芫荽中的總黃酮，對提取工藝的穩定性進行驗證。

1.2.4 刺芫荽總黃酮的抗氧化活性 分別測定刺芫荽總黃酮對·OH 和DPPH 自由基的清除率，以及對大豆油和玉米油的抗氧化活性。

1.2.4.1 對·OH 的清除率。參考孟良玉等[16]方法測定。將提取的黃酮用旋轉儀蒸發成膏狀，再用蒸餾水將其配成質量濃度分別為0.24、0.30、0.36、0.48、0.60、0.72 mg/mL 的黃酮溶液，并分別移取黃酮溶液2 mL 于容量瓶中。依次加入9 mmol/L 的FeSO4溶液和8.8 mmol/L 的H2O2各1 mL，混合均勻，室溫下靜置10 min；再加入9 mmol/L 的水楊酸2 mL，混合均勻，室溫下靜置30 min。用分光光度計在波長510 nm 處測定吸光度。用蒸餾水代替水楊酸作為空白對照，并測定吸光度。根據公式，計算·OH 的清除率：

E（·OH） （%） ＝［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（·OH） —羥基自由基的清除率（%）；A0—空白吸光度；A1—總黃酮提取物反應的吸光度；A2—水楊酸參加反應時總黃酮提取物的吸光度。

1.2.4.2 對DPPH 自由基的清除率。參考張曉璐等[17]方法測定。配制質量濃度為0.4 mg/mL 的刺芫荽總黃酮待測液；分別取待測液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL 比色管中，加入濃度0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL，再加95%乙醇至10 mL，混合均勻，室溫下放置20 min；離心，取上清液，用分光光度計在波長517 nm 處測定吸光度（A1）。另分別取待測液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于比色管中，加入95%乙醇至10 mL，其他操作同上，測定吸光度（A2）；用0.04 mg/mL 的DPPH 溶液2 mL 與95%乙醇8 mL的混合液作為參比，其吸光度記為（A0）。用質量濃度為0.4 mg/mL 的Vc 溶液代替總黃酮進行上述試驗，作為對照。根據公式，計算DPPH 自由基的清除率：

E（DPPH） =［1-（A1-A2） /A0］×100%

式中，E（DPPH） —總黃酮提取液對DPPH 自由基的清除率（%）；A0—DPPH 溶液＋95%乙醇反應后的吸光度；A1—DPPH 溶液+不同體積總黃酮提取液的吸光度；A2—95%乙醇+總黃酮提取液的吸光度。

1.2.4.3 對油脂的抗氧化活性。參考孟良玉等[16]方法測定。取250 mL 的燒杯6 只，分別加入大豆油100 g；另取250 mL 的燒杯6 只，分別加入玉米油100 g。試驗設刺芫荽總黃酮加入量0、0.2、0.4、0.6、0.8 g 計5 個處理，以加入Vc 0.2 g 作為對照；將油樣置于（65±1） ℃的烘箱中，每隔2 d 測定1 次過氧化值（POV，用過氧化物的毫克當量數表示）。每次取油樣2～3 g，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷與冰乙酸的混合液30 mL，立即振搖使其溶解；加入飽和碘化鉀溶液1 mL，蓋上塞子搖勻，在黑暗處放置3 min；加入蒸餾水100 mL，搖勻，并立即用0.002 mol/L 硫代硫酸鈉標準溶液滴定至淡黃色，再加入淀粉指示劑1 mL 繼續滴至藍色消失為終點。并取相同量的三氯甲烷-冰乙酸溶液以及碘化鉀溶液和蒸餾水，按照同一方法做空白試驗。根據公式，計算POV：

POV（meq/kg） =（V1－V2） N/W×1 000

式中，V1—試樣用去硫化硫酸鈉溶液的體積（mL）；V2—空白試驗用去的硫代硫酸鈉溶液體積（mL）；N—硫代硫酸鈉溶液的當量濃度（mol/L）；W—試樣質量（g）。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以吸光度（A）為縱坐標、濃度（C） 為橫坐標繪制標準曲線（圖1），得到回歸方程為A=10.18C＋0.003 7，R2=0.999 6。表明在溶液濃度為0.012 8～0.064 0 mg/mL時，吸光度與濃度具有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著乙醇濃度的增大，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢變化，其中乙醇濃度為60%時指標值最大，此時總黃酮得率為1.062%（圖2）。因此，篩選適宜的乙醇濃度為60%。

2.1.2 提取溫度對刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著提取溫度的升高，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢變化，其中提取溫度為70 ℃時指標值最大，此時總黃酮得率為0.857 8%（圖3）。因此，篩選適宜的提取溫度為70 ℃。

2.1.3 料液比對刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著料液比的增大，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢變化，其中料液比為1 ∶25 時指標值最大，此時總黃酮得率為0.988 0%（圖4）。因此，篩選適宜的料液比為1∶25。

2.1.4 提取時間對刺芫荽總黃酮得率的影響 隨著提取時間的延長，刺芫荽總黃酮得率呈先增加后降低的趨勢變化，其中提取時間為40 min 時指標值最大，此時總黃酮得率為0.988 0%（圖5）。因此，篩選適宜的提取時間為40 min。

2.3 正交試驗優化

在單因素試驗結果的基礎上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）進行四因素三水平的L934正交試驗設計（表1）。RA＞RB＞RD＞RC（表2），表明4 個因素對刺芫荽總黃酮得率的影響順序為乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間。在試驗因素的設計水平范圍內，優化提取刺芫荽總黃酮的最佳條件為A1B2C3D3，即乙醇濃度50%、料液比1∶25、提取時間50 min、提取溫度80 ℃。

表1 L934 正交試驗設計的因素及其水平Table 1 The factors and levels of L934 orthogonal experimental design

表2 正交試驗的刺芫荽總黃酮得率Table 2 The total flavonoids yield by orthogonal experiment

驗證試驗結果顯示，選用優選化的工藝條件提取刺芫荽總黃酮平均得率為1.385%，RSD 為1.55%，高于其他條件下的總黃酮得率。表明利用正交試驗優選出的A1B2C3D3超聲條件參數可靠，具有一定的實用價值。

2.4 黃酮的體外抗氧化活性

2.4.1 對·OH 的清除率 黃酮和Vc 對·OH 的清除率均隨溶液濃度的增大而遞增，在濃度0.048～0.144 mg/mL范圍內，黃酮對·OH 的清除率為13.99%～39.82%，與Vc 對·OH 的清除率（13.70%～43.21%） 基本相當（圖6）。表明刺芫荽總黃酮對·OH 具有較好的清除能力。

2.4.2 對DPPH 自由基的清除率 黃酮和Vc 對DPPH自由基的清除率均隨溶液濃度的增大而遞增，在濃度0.048～0.144 mg/mL 范圍內，黃酮對DPPH 自由基的清除率為55%～70%，低于Vc 對DPPH 自由基的清除率（83%～90%） （圖7）。表明刺芫荽總黃酮對DPPH 自由基有一定的清除能力。

2.4.3 抗油脂氧化能力 玉米油和大豆油加入黃酮后，油脂的POV 均明顯低于其未加入黃酮處理；但不同濃度黃酮的抗油脂氧化能力不同，在質量濃度0～0.8%范圍內，黃酮的抗油脂氧化能力隨著溶液濃度的增大而遞增（圖8 和9）。在質量濃度為0.2%條件下，Vc處理的抗油脂氧化能力明顯高于黃酮處理。進一步分析刺芫荽總黃酮對不同油脂的氧化抑制作用發現，相同濃度條件下，其對玉米油與對大豆油的抗氧化能力大體相當。表明刺芫荽總黃酮可以明顯抑制油脂氧化，在0.2%質量濃度下刺芫荽總黃酮的抗油脂氧化活性弱于Vc。

3 結論與討論

采用超聲輔助法提取刺芫荽中的總黃酮，通過單因素試驗對提取工藝中的單因素水平進行了篩選；在單因素試驗結果的基礎上，采用四因素三水平的正交試驗設計，對刺芫荽中總黃酮的提取工藝條件進行了優化。正交試驗結果顯示，乙醇濃度對刺芫荽總黃酮得率影響最大、超聲時間影響力度最小，最佳提取條件為乙醇濃度50%、料液比1 ∶25、提取溫度80 ℃、提取時間50 min，該條件下總黃酮得率為1.385%。在低的乙醇濃度范圍內，隨著乙醇濃度的增大，刺芫荽細胞發生溶脹現象，細胞中的黃酮類化合物溶出增加，刺芫荽總黃酮得率升高；當乙醇濃度繼續增大，根據相似相溶的原理，高濃度的乙醇溶液會溶解細胞中的色素、脂溶性等物質，從而使得總黃酮得率降低[10～12]。因此，在提取黃酮生產中，應注意乙醇濃度的控制。

在本研究中還對刺芫荽總黃酮的體外抗氧化能力進行了研究。結果表明，刺芫荽總黃酮提取物對·OH和DPPH 自由基均具有較好的清除能力，也具有較好的抗油脂氧化能力，但對DPPH 自由基的清除能力和抗油脂氧化能力弱于Vc。分析原因可能是使用的刺芫荽總黃酮為粗提物，未經過分離純化，含有較多雜質，進而影響了其抗氧化活性。這也為刺芫荽黃酮類化合物的進一步探索與開發利用提供了理論依據。