不同濃度NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響研究

劉桂蘭　周禮敬　楊林　詹會祥　王朝榮

摘 要：通過開展0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚成熟精子活力的影響研究，結果表明，在NaCl溶液濃度為0.2%～0.8%的范圍內，隨著濃度的升高，精子劇烈運動的時間和壽命時長均與NaCl濃度呈正相關;當濃度為0.8%時達到最大值，精子劇烈運動時間平均達35″63，平均壽命78″20;之后隨著NaCl濃度增加，精子劇烈運動時間和壽命時長均與藥物濃度呈負相關狀態。在人工繁殖時用濃度為0.8%NaCl溶液激活精子受精，平均受精率達到86.57%，比用養殖用水激活精子時的受精率高出22.11%，可大幅度提高四川裂腹魚的人工繁殖受精率。

關鍵詞：四川裂腹魚;NaCl;精子活力;受精率

中圖分類號 S962.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）08-0067-03

四川裂腹魚（Schizothorax kozlovi）是長江上游特有的魚類[1]，也是產區重要的經濟魚類，主要分布在長江上游的烏江、金沙江、雅礱江水系。近年來，受過渡捕撈、水環境污染、水工建筑等的影響，野生種群數量及分布區域急劇減少，漁獲物個體趨于低齡化、小型化、低質化。開展該魚類人工繁殖技術、基礎生物學特性的研究，已成為業內研究的熱點之一。目前，對四川裂腹魚的研究主要集中在繁殖力[2]、肌肉營養成分[3]、人工繁殖和苗種培育[4]、親魚培育[5]等方面，而關于其精子活力的研究還尚未見報道。

受精是魚類人工繁殖技術的關鍵點之一，如何提高受精率，為養殖生產帶來更大的經濟效益，已成為水產界的主要研究方向。影響魚類受精率的因素很多[6]，精子活力就是其中之一。用NaCl溶液激活精子活力目前在虹鱒、鯉魚、團頭魴、白點鮭、美國大口胭脂魚、光唇魚、半刺厚唇魚、興國紅鯉等魚類[7-13]中應用研究較多，而在裂腹魚種類的研究還未見報道。為此，本研究以四川裂腹魚作為試驗材料，觀察不同濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響，篩選使精子劇烈運動時間最長、壽命最大時的NaCl溶液濃度，并應用于生產實踐，以期大幅度地提高四川裂腹魚的人工繁殖受精率。

1 材料與方法

1.1 材料 四川裂腹魚雌雄親魚均來自畢節市鑫有公司雙坪養殖基地水泥池養殖的成熟親魚。NaCl購于山西同杰化學試劑有限公司生產，分析純。用蒸餾水配制不同濃度梯度即0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，對照實驗組為養殖場用水。觀察精子活力時采用三目生物顯微鏡（型號：BM2100）;在體式顯微鏡（型號：ZX-606M）下觀察四川裂腹魚的受精情況。

1.2 方法

1.2.1 采集精液及精子活力的觀察 每次取材時，擦干魚生殖孔周圍的水分，采用頭高尾低的姿勢，由前向后輕壓腹部，將精液擠入事先清潔好的培養皿中，取中段精液觀察，精液要求呈乳白色，無血無糞便污染。將載玻片置于16×40倍的電子顯微鏡下，分別用吸管吸取下列溶液一滴于載玻片上：養殖用水、0.2%NaCl、0.4%NaCl、0.6%NaCl、0.8%NaCl、1.0%NaCl、1.2%NaCl。然后用解剖針挑取少許新鮮精液與玻片上的溶液混合?；旌祥_始后立即采用秒表計時，觀察一個視野，精子活動等級參照吳景貴[14]之標準，即精液與溶液混合開始到75%的精子轉為中速運動的時間為劇烈運動時間，計時起到95%的精子停止運動時間為精子的壽命。每個溶液濃度用同一樣本分別做5次平衡實驗，取平均值分別得到精子的劇烈運動時間和壽命時間。

1.2.2 人工受精及受精率統計 采用人工干法授精的方式[15]：授精時將雌魚腹部水分擦干，用毛巾包裹雌魚，采用頭高尾低的姿勢，輕壓腹部將卵擠入清潔盆中;隨即用相同手法將雄魚擠出精液，快速攪拌精、卵，使之充分混合。每組隨機取1份加入500mL養殖用水激活精子，其余部分隨機分成3份分別用500mL的0.8%NaCl溶液激活精子。激活精子后晃動1～2min，室內靜置5min后洗卵。受精率的統計選擇在胚胎發育到原腸中期時，用小網隨機撈取魚卵100粒左右放在培養皿中，在體式顯微鏡下觀察，受精率統計參照危起偉等[16]方式進行。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl溶液對精子活力的影響 記錄在室溫18～20℃下采用不同濃度NaCl溶液激活精子，鏡下觀察記錄精子的劇烈運動時間和壽命時間（見表1）。由表1可知：在采用養殖用水激活時，精子的劇烈運動時間和壽命時間分別是22″49和62″57;在用0.8%NaCl濃度激活時，精子劇烈運動時間和壽命時間均達到最高值，分別為35″63和78″20。而其他濃度的NaCl溶液對四川裂腹魚精子活力的影響均低于0.8%時。

表1 不同濃度NaCl溶液的精子活力

[NaCl濃度 觀察次數 劇烈運動的平均時間（s） 平均壽命（s） 對照組 5 22″49 62″57 0.2%NaCl 5 17″88 40″82 0.4%NaCl 5 20″58 45″25 0.6%NaCl 5 23″20 70″49 0.8%NaCl 5 35″63 78″20 1.0%NaCl 5 20″82 40″92 1.2%NaCl 5 15″26 25″33 ]

2.2 不同濃度NaCl溶液對受精率的影響 取同批次精卵，在相同環境條件下，分別用養殖用水和0.8%NaCl溶液激活精子受精，在胚胎發育到原腸中期時測定受精率，結果見表2。由表2可知：0.8%NaCl溶液激活下的平均受精率為86.57%，養殖用水激活下的受精率為66.46%。

3 結論與討論

3.1 精子活力 魚類精子在精巢和精液原漿中是不活動的，當遇水或其他可激活物質時便開始劇烈活動，隨著時間延續，其自身儲存能量逐步消耗直至殆盡，生命終止。精液中含有鈉、鉀等金屬元素，鈉是其中主要起穩定滲透壓作用元素之一，對精子的激活和抑制有著非常重要的作用[17]。目前，已有大量的研究報道[10-13]指出，精子運動時間和壽命，與其所處介質的滲透壓環境有關，當外界滲透壓和其自身滲透壓相一致時，其壽命時間及劇烈運動時間達最大值，低于或高于精子本身的滲透壓，精子的運動都會受到不同程度的抑制。

羅芬等[11]通過對寬口光唇魚精子活力的研究，結果表明，當NaCl濃度為0.51%時，其精子的劇烈運動時間和壽命最長;張艷萍等[7]通過對虹鱒精子的活力研究，結果表明，3齡虹鱒精子在0.8%的NaCl溶液中，其精子活力達到最高，當高于此濃度時，精子的活力受到抑制;劉麗麗等[12]對半刺厚唇魚精子活力研究時得出，在NaCl濃度為0.7%時，其精子劇烈運動時間和壽命時間都是最長的。本試驗研究了0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%等不同濃度的NaCl溶液激活四川裂腹魚精子時，觀察記錄其精子劇烈運動時間和壽命，結果顯示，在NaCl溶液濃度0.2%～0.8%范圍內，隨著濃度升高，精子劇烈運動時間和壽命時長均與NaCl濃度呈正相關狀態，且濃度為0.8%時達到最大值，之后隨著NaCl濃度增加，精子劇烈運動時間和壽命時長均與藥物濃度呈負相關狀態。延長精子劇烈運動時間在生產中具有實踐意義，在此時間內更具有有效的受精能力[18]。因此，在進行人工繁殖時，采用0.8%NaCl溶液激活精子，在時間上為四川裂腹魚受精提供了更多機會，從而提高了受精率。

3.2 受精率 多年研究表明，四川裂腹魚在人工養殖條件下不能自然繁殖，人工繁殖是實現其種群規模擴大、滿足養殖需求的有效方法。已有研究表明，四川裂腹魚在人工繁殖時，采用養殖用水激活精子，其受精率最高僅為75.4%，平均為66.3%。本試驗在人工繁殖時采用濃度為0.8%NaCl溶液激活四川裂腹魚精子，精子劇烈運動時間平均達35″63，平均壽命78″20;而對照試驗用養殖用水激活四川裂腹魚精子時，精子劇烈運動時間平均僅為22″49，平均壽命62″57。用濃度為0.8%的NaCl溶液激活四川裂腹魚精子受精，最高受精率達93.02%，最低受精率83.63%，平均受精率86.57%，明顯高于采用養殖用水激活精子時的受精率。受精率高低除與卵子質量有關外，還與受精時精子劇烈運動時間、壽命有關，劇烈運動時間越長，將具有更強的競爭力，受精效果越好。

在常用的K+、Mg2+、Ca2+、Na+、葡萄糖、ATP等因子用于激活魚類精子時獲得更長劇烈運動時間及更長壽命周期，是否也適用于四川裂腹魚還有待進一步研究。

參考文獻

[1]危起偉，陳大慶，鄭海濤，等.長江水生生物多樣性保護系列叢書（1）：長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區科學考察報告[M]，北京：科學出版社，2012：212.

[2]陳永祥，羅泉笙.烏江上游四川裂腹魚繁殖力的研究[J]，動物學研究，1995（4）：324-342.

[3]陳永祥，胡思玉，趙海濤，等.烏江上游四川裂裂腹魚和昆明裂腹魚肌肉營養成分的分析[J].畢節學院學報，2009，27（8）：67-69.

[4]劉桂蘭，詹會祥，周禮敬，等.四川裂腹魚人工繁殖和苗種培育技術研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2018（11）：208-212，258.

[5]周禮敬，詹會祥.四川裂腹魚親魚培育技術[J]，齊魯漁業，2012，39（5）：20-21.

[6]鄧岳松，林浩然.精子活力的研究進展[J].生命科學研究，1999，3（4）：1-9.

[7]張艷萍，王太，婁忠玉，等.不同濃度的NaCI溶液對虹鱒精子活力的影響[J].中國農學通報，2013，29（14）：37-40.

[8]嚴安生，王其和，李詩模.滲透壓和鉀對鯉、團頭魴精子活力影響[J].淡水漁業，1993，23（3）：19-21.

[9]徐革鋒，劉洋，谷偉，等.白點鮭（Salvelinusleucomaenis）精子活力的觀察[J].水產學雜志，2012，25（2）：28-34.

[10]黃辯非，羅靜波，楊代勤，等.氯化鈉溶液對美國大口胭脂魚精子活力影響的觀察[J].湖北農業科學，2000，45（6）：61-62.

[11]羅芬，何學福.氯化鈉濃度對寬口光唇魚精子活力的影響[J].四川動物，1999，18（2）：70-72.

[12]劉麗麗，林丹軍，尤永隆.不同氯化鈉納濃度及pH值對半刺厚唇魚精子活力的影響[J].福建畜牧獸醫，2010，32（1）：10-12.

[13]黃辯非，羅靜波.氯化鈉溶液對興國紅鯉精子活力的影響[J].湖北農學院學報，2000，20（1）：62-64.

[14]吳景貴.鯉魚精子的壽命觀察報告[J].動物學雜志，1959，3（10）：462-465.

[15]殷名稱.魚類生態學[M].北京：中國農業出版社，1995.

[16]危起偉，李羅新，杜浩，等.中華鱘全人工繁殖技術研究[J].中國水產科學，2013，20（1）：1-11.

[17]蘇天鳳，艾紅.魚類精子活力及其超低溫保存研究綜述[J].上海水產大學學報，2004，13（4）：343-347.

[18]雷慧僧，姜仁良，王道尊，等.池塘養魚學[M].上海：上?？茖W技術出版社，1981：126-127.

（責編：張宏民）