均勻設計結合藥效學優(yōu)選酸棗仁復方提取工藝

李 建，朱 杰，全彥濤，于立芹，張華南

（1. 河南省生物技術開發(fā)中心，河南 鄭州 450002； 2. 河南省植物天然產物開發(fā)工程技術研究中心，河南 鄭州 450002）

酸棗仁復方是河南省生物技術開發(fā)中心實驗室從臨床治療失眠癥經方中篩選出的，以酸棗仁、百合、茯苓、大棗等組成的，具有鎮(zhèn)靜催眠功效的藥食兩用中藥復方。復方中君藥酸棗仁味酸、甘，性平，具有養(yǎng)心益肝、安神、斂汗之功效，為治療心肝血虛之心悸、失眠要藥[1]，占比最高；百合具有潤肺止咳、寧心安神功效；茯苓具有滲濕利尿、寧心安神功效，可治療心脾兩虛、心腎不交之失眠諸證[2]；大棗具有補中益氣、養(yǎng)血安神之功效。中藥復方藥效的影響因素眾多，提取方法為重要因素。《醫(yī)學源流論》曰：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此。”中藥方劑傳統(tǒng)提取方法多為水煎，而現(xiàn)代研究多認為高體積分數(shù)的乙醇對活性成分提取率較高[3]。為達到最佳藥效，本試驗中以延長戊巴比妥誘導小鼠睡眠時間為考察指標，通過均勻設計法優(yōu)選酸棗仁復方的提取工藝，為其工業(yè)生產和臨床應用提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀 器：CP224C 型 電 子 天 平（精 度 為0.1 mg），STX220 型便攜式天平（精度為0.1 g），均購自奧豪斯儀器＜上海＞有限公司；SB2100 型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

試藥：百樂眠膠囊（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號為17032841）；戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司，德國進口分裝，純度大于99%，批號為20170527）；炒酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.Spinosae （Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子（產自廣西），百合為百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或細葉百合L.pumilum DC. 的干燥肉質鱗莖（產自浙江），茯苓為多孔菌科真菌Wolfiporiacocos（Schwein.）的干燥菌核（產自云南），大棗為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill. 的干燥成熟果實（產自河南），均購自河南省世通醫(yī)藥有限公司，經河南省生物技術開發(fā)中心趙天增研究員鑒定為正品，經檢測均符合2015年版《中國藥典（一部）》相關項下要求。

動物：SPF 級雌性昆明種小鼠80 只，體質量為18 ～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（湘）2016－0002。自由飲水和攝食，12 h 晝夜節(jié)律變換，相對濕度為50% ～70%，溫度為（23±1）℃。試驗過程均符合動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1 組方設計與提取

采用均勻設計法，選用U*6（64）均勻設計表，以乙醇體積分數(shù)（因素A）、溶劑用量（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，每因素設置6 個水平，共有6 種提取工藝組合，各水平提取工藝見表1。復方中酸棗仁、百合、茯苓、大棗比例為50 ∶27 ∶19 ∶13。按此比例，準確稱量各藥材，將各藥材混合，按均勻設計表工藝提取，提取次數(shù)均為2 次，過濾后合并濾液，旋轉蒸發(fā)，干燥，計算干膏得率。

表1 提取工藝均勻試驗設計

1.2.2 動物分組與給藥

將小鼠隨機分為8 組，分別為組方1 組至組方6組、空白對照組、百樂眠膠囊組，每組10 只。組方1 組至組方6 組根據(jù)干膏得率折算小鼠給藥劑量，分別為1.26，1.35，1.11，1.15，0.85，1.08 g／kg，百樂眠膠囊給藥劑量為0.31 g／kg。各組藥物以0.5%CMC－Na 溶液配制，空白對照組灌胃0.5%CMC－Na 溶液。各組小鼠灌胃溶液體積均為10 mL／kg。

1.2.3 藥效學試驗

自主活動試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗第1 周、第2 周分別進行小鼠自主活動測試。測試前1 d 禁食16 h。給藥30 min 后，將小鼠置紙箱內，使其適應2 min 后，記錄后5 min 內活動次數(shù)（爬行格數(shù)）、站立次數(shù)（雙前肢向上抬舉次數(shù)）和理毛次數(shù)。

直接睡眠試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d，觀察給藥后是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標。當小鼠置于背臥位時，能立即翻正身位。如超過30 ～60 s 不能翻正者，即認為翻正反射消失，進入睡眠。翻正反射恢復即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間。記錄空白對照組與各給藥組入睡動物數(shù)。

延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗前1 d 禁食16 h。給藥后30 min，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg／kg，注射溶液量為10 mL／kg，以翻正反射消失為指標，觀察各藥物能否延長戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間。以翻正反射消失至恢復這段時間計為睡眠時間。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗：小鼠連續(xù)灌胃15 d。試驗前1 d 禁食16 h。給藥后30 min，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量40 mg／kg，記錄30 min內入睡動物數(shù)（翻正反射消失達1 min 以上者）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以表示，經正態(tài)分布檢驗后進行比較，各組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。相關性分析采用Pearson 法。均勻試驗設計的提取工藝優(yōu)化采用DPS 多元回歸分析，得回歸方程與最優(yōu)解。

2 結果

2.1 干膏得率

根據(jù)均勻設計試驗條件進行復方提取，組方1 至組方6 的 干 膏 得 率 分 別 為22.3% ，23.9% ，19.5% ，20.3%，14.9%，19.1%。可見，不同提取條件下干膏得率差異較大。

2.2 藥效學試驗結果

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g，n ＝10）

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g，n ＝10）

組別試驗開始前試驗第1 周試驗結束時組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.42 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.7 ±0.30 21.8 ±0.32 21.9 ±0.74 30.2 ±2.10 29.9 ±2.28 31.1 ±3.07 30.9 ±1.54 30.7 ±2.34 31.4 ±1.90 30.4 ±1.74 31.1 ±2.17 34.1 ±1.55 33.4 ±2.74 35.6 ±3.92 34.8 ±1.79 33.6 ±3.89 35.7 ±3.09 35.1 ±1.76 36.4 ±3.11

體質量：在試驗開始前及試驗第1 周、試驗結束時分別對小鼠體質量進行分析，結果見表2。各給藥組小鼠初始體質量與空白對照組相比無顯著差異（P ＞0.05），即各組小鼠的初始體質量較均衡；試驗第1 周及試驗結束時，各給藥組小鼠體質量與空白對照組相比均無顯著差異（P ＞0.05）。結果表明，各受試藥物對小鼠體質量增長無影響。

自主活動：結果見表3。給藥1 周后，與空白對照組相比，各組小鼠活動次數(shù)及站立次數(shù)均有下降，其中組方3 組小鼠活動次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.046）；組方1 組至組方3 組及百樂眠組小鼠站立次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.035，0.024，0.044，0.049）。給藥2 周后，除組方4 組外，其他各組小鼠活動次數(shù)與第1 周相比均有下降，其中組方1 組、組方3 組及百樂眠組小鼠活動次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.040，0.033，0.021），組方1 組至組方3 組小鼠站立次數(shù)與空白對照組相比下降顯著（P＝0.022，0.033，0.034）。給藥第1 周與第2 周，各組小鼠理毛次數(shù)與空白對照組相比均無顯著差異。

表3 各組小鼠自主活動情況比較（±s，次，n ＝10）

表3 各組小鼠自主活動情況比較（±s，次，n ＝10）

注：與空白對照組比較，▲P ＜0.05。

組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組第1 周47.3±18.5 46.7±25.1 42.7±30.9▲56.3±24.1 58.2±37.3 57.9±20.3 69.1±36.4 43.5±21.2第2 周41.8±20.6▲46.2±20.4 41.0±18.9▲66.9±22.8 46.8±27.0 54.3±22.5 62.2±13.5 37.9±13.4▲第1 周13.2±7.7▲12.2±13.4▲13.9±15.7▲19.7±13.8 21.0±19.2 19.4±11.5 27.6±18.5 13.5±9.0▲第2 周11.6±9.2▲12.2±12.8▲12.6±8.8▲29.0±18.3 14.9±14.8 18.0±11.2 24.8±8.1 13.5±6.6第1 周2.9±2.0 2.0±1.0 2.3±0.8 2.1±1.0 2.1±1.9 2.9±1.3 1.9±0.6 2.2±1.6第2 周1.9±1.6 1.7±1.1 2.1±1.4 2.7±1.3 2.6±1.7 2.6±1.1 2.0±0.9 1.6±1.4活動 站立 理毛組別

直接睡眠作用：各組小鼠給藥后，觀察60 min 內小鼠活動情況，給藥組與空白對照組均無睡眠現(xiàn)象發(fā)生，小鼠活動正常，表明各藥物及百樂眠膠囊均無直接睡眠作用。

延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間：結果見表4。可見，與空白對照組比較，組方2 組、4 組、6 組小鼠睡眠時間相近。組方5 組小鼠睡眠時間有所延長，但無顯著差異。組方1 組、組方3 組及百樂眠組小鼠睡眠時間顯著延長（P＝0.006，0.044，0.048），表明這些提取工藝條件有助于促進睡眠。

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間比較（±s，min，n ＝10）

表4 各組小鼠延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間比較（±s，min，n ＝10）

注：與空白對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別組方1 組組方2 組組方3 組組方4 組睡眠時間114.93±38.19▲▲60.35±25.48 100.75±44.23▲62.59±28.29組別組方5 組組方6 組空白對照組百樂眠組睡眠時間89.18 ±40.63 69.90 ±15.07 67.77 ±36.84 100.17 ±28.67▲

對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠效果：結果見表5。可見，各受試藥物均可增加閾下催眠劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠只數(shù)，表明組方1 至6 提取物與戊巴比妥鈉可能產生協(xié)同作用。

表5 各組小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠發(fā)生率比較（%，n ＝10）

2.3 多元回歸處理與相關性分析

采用DPS 軟件處理睡眠時間，經多元回歸得回歸方程Y＝67.29 ＋1.34X3－0.009 5X3X3＋0.005 9X1X2－0.008 8X1X3，R＝1.000 0，F(xiàn)＝4 600.345 9，回歸顯著性檢驗P＝0.011 1，表明該方程能較好地擬合各提取工藝對睡眠時間產生的影響。優(yōu)化結果為乙醇體積分數(shù)0、溶劑用量10 倍、超聲時間71 min。將組方1 組至組方6組小鼠睡眠時間與干膏得率進行Pearson 相關性分析，R＝－0.145，P＝0.785，差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 驗證試驗

為進一步考察優(yōu)選工藝的可靠性，按最佳提取工藝進行驗證試驗，操作方法同前。優(yōu)化工藝連續(xù)灌胃15 d后平均延長戊巴比妥鈉誘導睡眠時間為（116.0±24.53）min，顯著高于空白對照組的（62.32±35.28）min與百樂眠組的（92.18±30.40）min（P＝0.000），表明其具有鎮(zhèn)靜催眠作用，且藥效顯著優(yōu)于百樂眠膠囊。驗證結果與優(yōu)選試驗結果相當，表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

中藥復方以多成分多靶點作用于人體，各組分按一定比例組成了中藥復方的整體。在復方提取過程中，不同提取方法得到的有效成分的比例和含量各有差異，藥效差異可能較大。由于中藥復方組成復雜，藥效作用物質基礎通常不明確[4－5]。目前，常見工藝參數(shù)優(yōu)化方法多以復方干膏得率或復方中單個或多個化學成分的含量為評價指標[6－8]，但總量及個別化學成分不能代表復雜的物質基礎，故往往不能客觀、全面地反映在工藝變換過程中復方功效的變化，有時化學成分含量與藥效指標會顯示出矛盾的結果[9]。與之相比，采用藥效學指標評價具有結果直觀的優(yōu)點。本試驗結果表明，干膏得率與藥效學指標不相關，以干膏得率來評價工藝條件的優(yōu)劣并不適用。

酸棗仁為臨床治療失眠證常用中藥[10－12]。多項關于酸棗仁物質基礎及活性的研究均證明，酸棗仁水煎液及極性較強部位可延長閾上劑量戊巴比妥鈉所致睡眠時間，增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率，具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用[13－15]。本試驗中以戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間為指標考察酸棗仁復方提取工藝，結合工業(yè)生產的可行性，設計了不同醇體積分數(shù)、溶劑用量及提取時間對提取工藝的參數(shù)進行優(yōu)化，確定其最佳提取工藝為水提取。這與傳統(tǒng)提取方式一致（以水為溶劑），對生產設備及車間的安全要求相對較低，具有安全、無毒、生產成本低優(yōu)點，若后續(xù)通過樹脂分離純化活性部位，可直接提取液上樣，不需回收溶劑，樹脂使用壽命長。為更好地控制復方質量，不同提取工藝對復方有效成分含量及其比例的影響仍有待進一步研究。