卵巢護養膏貯存期間的質量研究*

鄔素珍，吳聲振，吳向維

（廣東省佛山市禪城區中心醫院，廣東 佛山 510530）

中藥膏方因口感好、攜帶方便等優點[1]，逐漸成為人們養生保健的重要選擇。中藥膏方是中藥的特有劑型，制作過程需經浸泡、煎煮、過濾、濃縮、收膏、涼膏、分裝等復雜工序，需進行嚴格的質量控制，以保證制劑安全有效[2－5]。中藥膏方制作過程不添加防腐劑，因其含水量低，滲透壓高，可有效抑制微生物滋生，常溫下可存放90 d 以上[6－8]，但其有效成分在貯存過程是否發生變化尚不明確。卵巢護養膏是由二仙湯加減組成，臨床用于治療腎虛證卵巢儲備功能不全、骨質疏松癥、老年性失眠等更年期癥狀[9－11]，需長期服用。為保證治療期間膏方功效穩定，本研究中以微生物限度、相對密度、淫羊藿苷含量為指標，研究其貯存期間的質量變化，為膏方的服用期限提供試驗依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC－20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司），BT25S 型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）；微壓中藥煎煮機（北京東華原醫療設備有限公司）；KQ2200E 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX－9023 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；并聯式中藥膏方濃縮制備系統（自主研發，專利號為201620659405.0）。

試藥：淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110737－201516）；水為重蒸水，其他試劑均為色譜純；仙茅、淫羊藿、浮小麥、巴戟天等中藥飲片，均購自廣州至信藥業股份有限公司，經佛山市食品藥品檢驗檢測中心鐘然主任藥師鑒定為正品；卵巢護養膏（醫院制劑，批號分別為1080601，1080602，1080603）。

2 方法與結果

2.1 微生物限度檢測

根據2015年版《中國藥典（四部）》通則[12]中微生物計數法（通則1105）和控制菌檢查法（通則1106）進行操作，于第0，10，20，30，60，90，120 天對3 批供試品進行抽樣檢定。結果供試品在120 d 內的細菌菌落計數均不超過10 cfu／mL（限度標準為≤100 cfu／mL），表明微生物限度符合規定，且均未檢出大腸埃希菌和沙門菌，詳見表1。

2.2 淫羊藿苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：AmethystC18－H 柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（30 ∶70，V／ V）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL／min；進樣量：10 μL。理論板數按淫羊藿苷峰計不低于1 500。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得（質量濃度為360 μg／mL）。

供試品溶液：淫羊藿藥材按處方調配后，加8 倍藥材質量的水，置不銹鋼桶浸泡4 h，待藥材充分吸脹后，置并聯式中藥膏方濃縮制備系統中煎煮3 次，每次煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.2 ～1.3 的稠膏，分裝至玻璃廣口瓶中，待涼膏后密封保存。取供試品，105 ℃下真空干燥3 h 后，冷卻至室溫，取0.5 g，精密稱定，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

表1 卵巢護養膏微生物限度檢測結果（cfu／mL）

陰性對照品溶液：按處方比例稱定除淫羊藿外的所有藥材，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取2.2.2 項下3 種溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取不同體積的對照品溶液，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質量濃度為180，120，90，45，15 μg／mL 的系列溶液。按擬訂色譜條件測定峰面積，以對照品質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝39 862X＋82.18，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，淫羊藿苷質量濃度在15 ～180 μg ／mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：精密量取質量濃度為15.0 μg ／mL 的對照品溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。依次改變進樣量，測定檢測限和定量限。信噪比（S／ N）約為1 ∶3 時，進樣量為5 μL，測定檢測限絕對值為7.5 ng；S／ N約為1 ∶10 時，進樣量為20 μL，測定定量限絕對值為30 ng。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為90μg／mL 的對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6 次，記錄淫羊藿苷的峰面積。結果的RSD為1.05%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，12 h 時進樣，記錄淫羊藿苷峰面積。結果的RSD為1.27%（n＝6），表明供試品溶液12h 內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品，依法平行制備6 份供試品溶液，記錄淫羊藿苷的峰面積。結果的RSD為1.03%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（ 批號為1080601）6 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別按樣品含量－加入量1 ∶1 的比例加入一定量的對照品溶液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結果見表2。

表2 淫羊藿苷加樣回收試驗結果（ n ＝6）

2.3 相對密度測定

按2015年版《中國藥典（四部）》通則0183[12]煎膏劑項下規定，取3 批供試品，每批各3 瓶，進行相對密度測定。結果樣品相對密度在120 d 內穩定，詳見表3。

圖1 高效液相色譜圖

表3 卵巢護養膏貯存期間相對密度質量研究結果

2.4 貯存期間質量研究

取3 批供試品，常溫下貯存120 d，使用清潔的干燥藥匙，分別在第0，10，20，30，60，90，120 天抽樣，檢測其淫羊藿苷的含量。結果見表3。可見，淫羊藿苷含量在90 d內相對穩定，第120 天略有下降。

3 討論

本研究中分別以甲醇和稀乙醇為溶劑，超聲提取30 min，結果甲醇提取的供試品溶液中淫羊藿苷含量更高，故確定甲醇為提取溶劑。分別超聲提取10，20，30，40 min，結果測得淫羊藿苷含量最高的是提取30 min 與40 min，故選擇甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液的制備方法。以不同比例的甲醇－水、乙腈－水為流動相進行試驗，結果流動相為乙腈－水（30 ∶70，V／ V）時理論板數更高，分離度更好，故選擇乙腈－水（30 ∶70，V／ V）為流動相。

中藥膏方對原料來源、制作工藝、貯存容器要求較高，質量控制不當易導致膏方貯存期間微生物限度超標。相對密度是評價膏方質量的指標之一，可間接反映中藥膏方的含水量，相對密度越低，含水量越高的膏方更易霉變[13－15]。故本研究中以微生物限度及相對密度為卵巢護養膏的質量評價指標，考察其貯存過程含水量的變化。

卵巢護養膏在貯存過程相對密度始終維持在1.2 ～1.3 間，此狀態下膏方表面光滑，流動性好，口感光滑。貯存期間微生物限度考察合格，表明膏方在此含水量下可長期存放，符合質量控制要求。同時說明其包裝容器可有效隔絕外界水分侵入，防止微生物滋生，為包裝的選用提供了有力的佐證。貯存期間淫羊藿苷含量測定結果發現，其在90 d 內穩定，此后開始下降，降幅約為10%，故卵巢護養膏在常溫下的保存期限以120 d為宜。改變貯存條件是否會對其保存期限造成影響，需在下一步的試驗設計中完善。