高效液相色譜法測(cè)定決明子4 種成分含量

申玉龍，徐 達(dá)，金艷敏，劉 勇，王立偉，安麗娜△

（1. 承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 承德 067600； 2. 河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051）

決明子主要含蒽醌類，有橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、美決明素、黃決明素、決明素、蘆薈大黃素等多種蒽醌苷元和與糖結(jié)合成的苷類[1－4]，具有清熱明目[5]、潤(rùn)腸通便[6]功效。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[7]中以橙黃決明素和大黃酚為決明子藥材的檢測(cè)指標(biāo)，其供試品溶液的前處理方法煩瑣、復(fù)雜。本研究中采用普通的高效液相色譜儀、等度洗脫，同時(shí)測(cè)定了決明子中橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC－20AT 型高效液相色譜儀，包括DGU－20A型泵，SPD－M20A 型二極管陣列檢測(cè)器，LC－solution 型色譜工作站，SIL－20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津公司）。

試藥：決明子藥材（共3 批，承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司），由河北省藥品檢驗(yàn)研究院韓桂茹主任藥師鑒定為決明子Gassia obtusifoliaL. 的種子；橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)為111900－201202，供含量測(cè)定用，含量以95.0%計(jì)），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756－200110，供含量測(cè)定用），大黃酚對(duì)照品（批號(hào)為110796－201319，供含量測(cè)定用，含量以99.6%計(jì)），大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)為110758－201013，供含量測(cè)定用，含量以99.8%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（批號(hào)為161218）、乙腈（批號(hào)為161123）均為色譜純，均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠，批號(hào)為090903）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：迪馬Dimonsil 柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－甲醇－0.1%磷酸溶液（49∶7∶44，V／ V／ V），等度洗脫；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：222nm；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按橙黃決明素峰計(jì)應(yīng)不低于6000。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取在干燥器中干燥24 h 的橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成原液，取原液適量，加90%甲醇制成每1 mL含橙黃決明素0.009 mg、大黃素0.004 mg、大黃酚0.015 mg、大黃素甲醚0.004 mg 的混合溶液，即得。

供試品溶液：取決明子藥材細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－鹽酸溶液（10 ∶1，V／ V）25 mL，稱定質(zhì)量，置80 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，若瓶壁有黏附，超聲去除，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液3 mL，置10 mL容量瓶中，加2%氫氧化鈉溶液1.5 mL，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取每1mL 含橙黃決明素0.01232mg、大黃素0.008 7 mg、大黃酚0.014 78 mg、大黃素甲醚0.008 mg 的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2，5，10，15，20 μL，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程分別為，橙黃決明素Y＝3 396 367.8X＋770，r＝0.99999；大黃素Y＝3822412.5X－392 3，r＝0.999 99；大黃酚Y＝5 819 232.8X－6 655，r＝0.999 99；大黃素甲醚Y＝2 929 021.8X－7 557，r＝0.999 98。結(jié)果表明，橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大 黃 素 甲 醚 進(jìn) 樣 量 分 別 在0.024 64 ～0.246 4 μg，0.017 4 ～0.174 μg，0.029 56 ～0.295 6 μg，0.016 ～0.16 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果橙黃決明素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積平均值分別為284 616，77 743，780 744，131 634，RSD分別為0.63%，0.41%，0.40%，0.51% （n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，8，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.41% ，0.27% ，0.06% ，0.64% （n＝5），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》中藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則項(xiàng)下規(guī)定，采用同一濃度的6 份樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，即以100%的劑量，取同一批樣品（1 號(hào)樣）6 份，依法制備供試品溶液，并測(cè)定含量。結(jié)果樣品中橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為1.430，0.350，2.251，0.792 mg／g，RSD分別為0.13%，0.42%，0.09%，0.32% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法，取已知含量的同一批樣品6 份（1 號(hào)樣），每份0.25 g，按1 ∶1 的比例加入相應(yīng)量的對(duì)照品，依法制備供試品溶液，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

因是單味藥材，空白試劑無(wú)干擾，僅提供樣品的測(cè)定圖譜，詳見(jiàn)圖1。含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 測(cè)定方法選擇

采用普通的色譜儀、等度洗脫，以乙腈－甲醇－0.1%磷酸溶液（49 ∶7 ∶44，V／ V／ V）為流動(dòng)相，在（222±1）nm波長(zhǎng)處同時(shí)測(cè)定決明子藥材中橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，各波峰分離度符合要求，進(jìn)樣1 針，35 min 出峰完畢。一臺(tái)普通液相色譜儀即可完成測(cè)定，試驗(yàn)成本降低，普及范圍大。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n ＝6）

圖1 高效液相色譜圖

表2 決明子4 種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3.2 供試品溶液前處理程度改進(jìn)

2015年版《中國(guó)藥典》中需甲醇加熱回流提取，取適量提取液蒸干、殘?jiān)偌酉←}酸水解，水解液用三氯甲烷萃取4 次，萃取液再蒸干，用溶劑定容。粗略地計(jì)算，處理1 批樣品需有機(jī)溶劑195 mL，耗時(shí)5 ～6 h，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且嚴(yán)重污染環(huán)境。以無(wú)濃縮、萃取、蒸干的環(huán)保方法，取代了甲醇提取、提取液蒸干、水溶解、三氯甲烷萃取、萃取液再蒸干、有機(jī)溶劑定容的傳統(tǒng)方法，效率提高、時(shí)間縮短、環(huán)境污染降低，精密度和準(zhǔn)確度提升。

3.3 流動(dòng)相等度洗脫程序選擇

目前，決明子或其制劑的含量測(cè)定中多數(shù)是測(cè)定橙黃決明素和大黃酚含量[8－11]，也有測(cè)定橙黃決明素、大黃素、大黃酚含量的[12]，還有測(cè)定橙黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的[12－13]，最多測(cè)定到12 種蒽醌類成分[14]，均為梯度洗脫，除采用超高效液相色譜法，特定的超高效液相色譜柱出峰時(shí)間在4 min[12]（但波峰分離不佳，尤其是樣品中大黃素波峰保留時(shí)間與對(duì)照品相差較大）內(nèi)外，其余測(cè)定4 種成分的梯度洗脫時(shí)間多設(shè)定為40 min 以上。