聚合酶鏈式反應法篩選龍膽栽培品最佳采收期*

吳艷蓉，賈凌云

（1. 遼寧省沈陽市肛腸醫院藥劑科，遼寧 沈陽 110002； 2. 沈陽藥科大學中藥學院，遼寧 本溪 117004）

采收期是指中藥材的采收時間，中藥材的采收期對其有效成分含量、制劑質量、臨床療效等均有直接影響[1]。龍膽始載于《神農本草經》，被列為中品。陶弘景曰：“……根狀似牛膝，味甚苦，故以膽為名?！敝兴廄埬憺辇埬懣浦参飾l葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽Gentiana scabraBge、三花龍膽Gentiana trifloraPall. 或堅龍膽Gentiana rigescensFranch. 的干燥根和根莖[2]。本研究中應用以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎的分子標記技術，建立了遼寧省道地藥材龍膽Gentiana scabraBge.栽培品的種質標準，并確定了篩選的龍膽栽培品最佳采收期。現報道如下。

1 龍膽栽培品種質標準的建立

1.1 儀器與試藥

儀器：PTC100TM型PCR 儀（Programmable Thermal Controller MJ Research Inc USA）；DYY－Ⅲ23A 型電泳槽，ECP3000 型三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）；TGL－16G 型臺式高速離心機（上海醫用分析儀器總廠）；UV755B 型紫外可見分光光度計（上海分析儀器總廠）。

試藥：十二烷基硫酸鈉（SDS） 提取緩沖液[100 mmol／L NaCl，50 mmol／L 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0），50 mmol／L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris－HCl，pH 8.0），0.5%SDS，0.8% β－Me，dNTPs，緩 沖 液（buffer）]，Taq DNA 聚 合 酶，隨 機 擴 增 多 態 性DNA（RAPD）隨機引物，溴化乙啶（EB），均購自上海生物工程有限公司；DNA Maker 購自天根生化科技（北京）有限公司；蒸餾水為無菌重蒸餾水，其余試劑均為分析純。龍膽栽培品（共5 批，產地均為遼寧省清原縣）；堅龍膽對照藥材（批號為120988－200403），龍膽對照藥材（批號為121530－201602），龍 膽 苦 苷 對 照 品（批 號 為110770－201716），均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法學考察

供試品提取溶劑的制備：分別采用SDS 法、CTAB法、高鹽低pH 法提取龍膽藥材，將提取的總DNA 溶液稀釋后，用紫外可見分光光度計于260 nm 及280 nm 波長處測定吸光度（A）。結果SDS 法最佳，詳見表1。

表1 SDS 法提取紫外檢測結果

模板、引物、酶用量對RAPD 擴增的影響：結果見表2?？梢姡_定RAPD 擴增最佳條件為模板含量28 ～30 ng，引物量20 ng，酶用量1.5 ～2.0 U，94 ℃預變性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 個循環，72 ℃保溫5 min[3]。

表2 模板、引物、酶用量考察結果

1.3 溶液制備

取0.2 g 供試藥材，置研缽，用液氮冷卻，研成細粉，置2 mL Epperdorf 管中，加入400 μL SDS 提取緩沖液，56 ℃溫浴30 min，加入等體積的苯酚－氯仿－異戊醇（25 ∶24 ∶1，V／ V／ V）抽提，混勻，以10 000 r／min 離心5 min，吸取上清液，置另1 支2 mL Epperdorf 管中，用上述抽提液重復抽提，直至蛋白沉淀完全為止，吸取上清液，與2 倍體積無水乙醇混勻[3]，于－20 ℃放置20 min，離心，得沉淀。用70%乙醇洗滌2 次，干燥，溶于無菌重蒸餾水中，得供試品溶液。分別取堅龍膽及龍膽對照藥材各0.2 g，依法分別制成對照藥材溶液。

1.4 DNA 擴增與檢測結果

分別以供試品溶液及對照品溶液為模板，引物為50 種RAPD 隨機引物，進行RAPD 反應，反應總體積為25 μL，置PTC－100 型PCR 儀上擴增。反應成分：buffer（Mg2＋），400 μm dNTPs，2 U Taq 酶，20 ng 引物，30 ng 模板；反應程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃10 s，36 ℃35 s，72 ℃70 s，43 個循環，72 ℃保溫5 min。反應結束后，通過1.4%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在紫外透射反射條件下觀察結果、照相，并將擴增產物長度與DNA Marker進行比較[3]。結果在與對照藥材龍膽相應位置出現相同的條帶，與對照藥材堅龍膽有顯著差異，可作為龍膽（栽培品）的種質標準。龍膽DNA 指紋圖譜見圖1。

圖1 龍膽DNA 指紋圖譜

2 龍膽栽培品最佳采收期的確定

2.1 儀器與試藥

儀器：LC－10AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Diamosil C18柱（迪馬公司）；DL－360 型超聲波清洗器（浙江省象山縣石浦海天電子儀器廠，功率為180 W，頻率為30 ～40 kHz）。

試藥：甲醇（色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。生長年限為2 ～5年的龍膽栽培品。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamosil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－水（24 ∶76，V／ V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按龍膽苦苷峰計不低于3 000，與相鄰峰的分離度大于1.5，系統適用性良好。

2.3 溶液制備

對照品溶液：取龍膽苦苷對照品2 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質量濃度為0.2 g／L 的溶液，即得[2]。

供試品溶液：取龍膽粉末0.5 g（過4 號篩），精密稱定，精密量取甲醇20 mL，置同一具塞錐形瓶中并稱定質量，加熱回流15 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液備用，精密量取續濾液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[2]。

2.4 方法學考察

線性關系考察：取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制得質量濃度為0.05，0.10，0.20，0.40，0.80 g／L 的對照品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以龍膽苦苷質量濃度（X）為橫坐標、相應峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回 歸 方 程Y＝600 722 882.258 1X＋3 401 944.5，r2＝0.999 6（n＝5）。結果表明，龍膽苦苷質量濃度在0.05 ～0.80 g／L 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6 次，每次10 μL，記錄龍膽苦苷峰面積。結果的RSD為1.52%（n ＝6），表明儀器精密度符合要求。

重復性試驗：取6 份樣品各0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進樣測定龍膽苦苷的含量。結果的RSD為1.61%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12 h 時進樣測定，記錄龍膽苦苷峰面積。結果的RSD為1.96%（n ＝6），表明供試品溶液在制備后12 h 內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品0.5 g，精密稱定，共3 份，按高、中、低分別加入龍膽苦苷對照品，依法制備供試品溶液，依法測定并計算回收率。結果見表3。

2.5 樣品含量測定

取經篩選的龍膽栽培品，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，色譜圖見圖2。5 批樣品的含量分別為4.29%，4.53%，4.48%，4.27%，3.93%。

表3 龍膽苦苷加樣回收試驗結果（n ＝9）

圖2 高效液相色譜圖

2.6 最佳采收期確定

4 個批次不同采收季節和4 個批次不同生長年限的龍膽栽培品中龍膽苦苷的含量變化見圖3。

3 討論

中醫取龍膽苦寒之性，瀉肝膽實火，除下焦濕熱[4]。東北的關龍膽以產量最大、質量最好成為藥材市場的主流而行銷全國，并有出口[5－6]。中藥龍膽中最主要的有效成分為龍膽苦苷等環烯醚萜苷類化合物[7－8]，具有抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽等生物活性[6]。故本研究中以龍膽苦苷為指標成分，對應用PCR 法進行篩選的遼寧省道地藥材龍膽Gentiana scabraBge. 栽培品進行最佳采收期研究。

關于龍膽苦苷的HPLC 含量測定方法，以甲醇－磷酸水溶液系統為流動相進行梯度洗脫，270 nm 為檢測波長[9]；以乙腈－磷酸水溶液系統為流動相，240 nm 為檢測波長[10－11]；文獻[12－16]和2015年版《中國藥典（一部）》中均以甲醇－水系統為流動相，270 ～275 nm 為檢測波長測定龍膽苦苷。本研究中參考以上文獻，對龍膽苦苷測定方法進行篩選，最終確定甲醇－水（24 ∶76，V／ V）為流動相，以270 nm 為檢測波長。

圖3 不同采收季節和生長年限龍膽栽培品中龍膽苦苷含量

由龍膽苦苷的含量測定結果可見，秋季采收的龍膽栽培品中龍膽苦苷含量高于春季采收的龍膽栽培品，但二者含量均高于2015年版《中國藥典（一部）》龍膽藥材項下規定的龍膽苦苷含量[2]，故春秋兩季均可采收。生長年限為2 ～5年的龍膽栽培品中，以3年生長龍膽苦苷含量最高，故確定龍膽栽培品的最佳生長期為3年。

近年來，我國野生中藥材資源呈明顯下降趨勢，特別是道地藥材的野生資源日益匱乏，拯救和保護瀕危中藥材資源刻不容緩，沒有科學指導的移栽品更是降低了臨床療效[11，17]。優良的種質資源是道地藥材品質形成的內因，對優良種質資源進行篩選和深入研究，有助于對道地藥材優良品種的推廣和發展。RAPD 是目前用于作物種質資源鑒定的一種分子標記技術[18]。PCR 法是DNA 分子水平PCR，被稱為檢測基因多態性的常規技術，代表中藥品種變異類型的遺傳標記。故本研究中采用PCR 法測定龍膽種質標準。應用PCR法篩選龍膽栽培品簡單易行，結果可靠，可據此探索建立道地中藥材種子的PCR 法篩選標準，以篩選優良的中藥材種質資源，推廣道地中藥材的規范化種植。這對于挽救中藥資源的流失和枯竭，促進中藥資源的保護和發展，提高中藥質量標準制訂水平均有重要意義。