侗藥馬卡列丙化學成分預試驗及總多糖含量測定*

譚紫玲，王李婷，智馨君，王向根，江仁峰，劉良紅，2△

（1. 湖南醫(yī)藥學院藥學院，湖南 懷化 418000； 2. 侗醫(yī)藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000）

馬卡列丙（侗藥名）Duhaldea nervosa（Wallich ex Candolle）A.Anderberg（D.nervosa）又名毛秀才（湖南）、小黑藥（云南）、草威靈（貴州）等[1]，是菊科羊耳菊屬植物顯脈旋覆花[2]的全草，主要分布在四川西部和西南部、云南北部至南部、貴州西部至北部和廣西西部的山地雜木林下、草坡和濕潤草地，在越南、緬甸、泰國、印度、不丹、錫金、尼泊爾亦有分布[2]，具有祛風除濕、活絡(luò)止痛、健胃消食之功效，主要用于治療風濕疼痛、腰膝酸軟、跌打損傷和骨折，可顯著縮短骨折病程，是侗族人民常用的跌打損傷特效藥[3－4]。目前，關(guān)于馬卡列丙的研究主要集中于生物學特性和少量的弱極性化學成分（如萜類、甾體類和揮發(fā)油類成分[5－9]），但對其極性成分研究較少，僅有本課題組關(guān)于綠原酸類成分定性和定量的研究[10－11]?；瘜W成分預試驗表明，馬卡列丙含有大量多糖，多糖是來自高等植物、動物細胞膜、微生物細胞中的天然大分子物質(zhì)，是自然界含量最豐富的生物聚合物[12－13]，是維持生命活動正常運轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。多糖能減輕關(guān)節(jié)腫脹，抑制關(guān)節(jié)疼痛、滑膜增生、炎癥，降低骨內(nèi)壓，清除氧自由基，改善局部微循環(huán)等作用[14－16]。本研究中首次采用系統(tǒng)預試驗法對馬卡列丙的化學成分進行較全面的檢測，明確了其可能的化學成分，尤其是極性成分的種類，并測定了其總多糖含量，為研究其活性成分的提取及化學成分與藥理活性間的關(guān)系提供試驗基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：HH 型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市中大儀器廠）；ZF－1 型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；LC－350A 型超聲提取儀（山東濟寧魯超超聲設(shè)備有限公司）；PTX－FA210 型電子分析天平（上海實潤實業(yè)有限公司）。

試藥：馬卡列丙的干燥根及根莖，于2017年5月采購自云南，經(jīng)湖南醫(yī)藥學院汪冶教授鑒定為正品，藥材粉碎，過4 號篩，得粗粉。純化水（自制）；乙醇（批號為20180406）、甲醇（批號為20180906），正丁醇（批號為20180116）、鹽酸（批號為20180102），醋酐（批號為20140416），濃硫酸（批號為20180310），均購自成都金山化學試劑有限公司；氫氧化鈉（西隴科學股份有限公司，批號為190103），茚三酮（批號為20170924），硅鎢酸試劑（批號為20180425），鹽酸羥胺（批號為20180822），碳酸鈣（批號為20170813），氯化鈉（批號為20181206），溴酚藍（批號為20170617），均購自國藥集團化學試劑有限公司；明膠（批號為20160619），鎂粉（批號為20170127），三氯化鋁（批號為20171226），三氯化鐵（批號為20170624），硼酸（批號為20180120），香草醛（批號為200509015），均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；氯仿（天津市富宇精細化工有限公司，批號為20170425）；碘化鉍鉀（天津市光復精細化工研究所，批號為20171110）；高錳酸鉀（廣東省化學試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，批號為20120624）；3，5－二硝基苯甲酸試劑（上海試劑三廠，批號為811123）；苯酚（天津市永大試劑有限公司，批號為20190119）；D－（＋）－Glucose（Stanford Chemicals，批號為TC170820）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學成分預試驗

2.1.1 供試液制備[17]

水供試液：取粗粉10 g，精密稱定，浸于100 mL 蒸餾水中，超聲1 h，濾過，取10 mL 濾液，作為冷水提取液，用于氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的檢測；余液和殘渣在60 ℃水浴中加熱1 h，濾過，得熱水提取液，用于糖、苷類、皂苷、酚類和鞣質(zhì)、生物堿、黃酮類、有機酸和一般有機化合物等的檢測。

乙醇供試液：取粗粉10 g，精密稱定，浸于100 mL 95%乙醇中，超聲1 h，濾過，可用于黃酮類、蒽酮類、酚類和鞣質(zhì)、有機酸、香豆素和內(nèi)酯類、強心苷、生物堿、三萜類和甾醇的檢測。

石油醚供試液：取粗粉10 g，精密稱定，加100 mL石油醚，并超聲1 h，濾過得石油醚供試液，用于甾體、三萜類化合物、揮發(fā)油和油脂的檢測。

2.1.2 預試驗結(jié)果

采用試管試驗法對上述馬卡列丙水提取液、乙醇提取液和石油醚提取液進行化學成分檢查，通過各種不同成分特有的顏色反應和沉淀反應，初步鑒定供試液可能含有的化學成分類型。結(jié)果見表1 至表3。根據(jù)預試驗結(jié)果，若檢查某類成分的結(jié)果呈陽性反應，則初步判斷馬卡列丙中含有某類成分；若為陰性反應，則判斷不含某類成分?？梢姡R卡列丙含有多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、2，6－去氧糖、鞣質(zhì)、有機酸、皂苷、黃酮、生物堿、蒽醌類、酚類、香豆素、內(nèi)酯類、甾體和三萜、揮發(fā)油類等化學成分，其中還原糖、皂苷、生物堿、酚類化合物的反應明顯，可能在馬卡列丙中含量較高。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 溶液制備

供試品溶液制備：取1 g 樣品粉末，精密稱定，加入80%乙醇100 mL，于90 ℃回流提取1 h，趁熱過濾，濾渣連同濾紙置燒瓶中，加水100 mL，稱定質(zhì)量，于70 ℃回流提取2.5 h，稱定質(zhì)量，補液，趁熱過濾，取續(xù)濾液1 mL置50 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 水供試液化學成分預試驗結(jié)果

表2 乙醇供試液化學成分預試驗結(jié)果

表3 石油醚供試液化學成分預試驗

對照品溶液：取無水葡萄糖標準品0.005 01 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得貯備液。分別吸取適量的貯備液，稀釋定容，制成最終質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80，100 μg／mL 的對照品溶液。

2.2.2 檢測波長選擇

多糖在濃硫酸作用下水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，與苯酚縮合成橙黃色化合物，通過紫外－可見分光光度法定量測得多糖類物質(zhì)的含量[18]。在200 ～1 000 nm 波長范圍內(nèi)對馬卡列丙多糖和葡萄糖進行全波長掃描。結(jié)果表明，馬卡列丙多糖和葡萄糖均在491 nm 波長處有最大吸收。

2.2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密量取葡萄糖標準系列溶液各2.0 mL，分別置10 mL 帶塞試管中，依次加入5%苯酚試劑1.0 mL，逐滴勻速加入濃硫酸溶液5 mL，置沸水浴中加熱20min，冷卻至室溫，用紫外分光光度計在491nm 波長處測定其吸光度，并以無水葡萄糖質(zhì)量濃度（C，g ／ L）為橫坐標、吸光度值（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A＝6.929 9C＋0.002 1，R2＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，經(jīng)顯色后的無水葡萄糖質(zhì)量濃度在0.01 ～0.1 g／L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液2.0 mL，按擬訂方法顯色，測定吸光度，重復測定6 次。結(jié)果的RSD為0.15%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取同一供試品溶液2 mL，分別于0，2，4，6，8，10 h 時按擬訂方法測定吸光度。結(jié)果的RSD為0.11%（n ＝6），表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：準確稱取樣品各0.5 g，依法制備供試品溶液，按擬訂方法測定吸光度。結(jié)果的RSD為1.8%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取供試品溶液1 mL，各6份，加對照品溶液1 mL，按擬訂方法顯色，測定吸光度，計算加樣回收率。結(jié)果見表4。

表4 多糖加樣回收試驗結(jié)果（ n ＝6）

2.2.4 總多糖含量測定

按重復性試驗項下方法測定總多糖含量。結(jié)果6 份樣品中總多糖含量分別為32.75%，32.32%，33.76%，32.39%，32.17%，32.89%，平均32.71%。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，馬卡列丙可能含有多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、2，6－去氧糖、鞣質(zhì)、有機酸、皂苷、生物堿、蒽醌類、酚類、香豆素、內(nèi)酯類、甾體和三萜類等化學成分，其中還原糖、皂苷、生物堿、酚類化合物的反應明顯，可能含量較高。通過取適量綠原酸類成分對照品與三氯化鐵或鐵氰化鉀三氯化鐵反應表明，酚類成分主要為綠原酸類成分，與本課題組前期報道[10]一致，而皂苷和生物堿類成分尚未見文獻報道，在后續(xù)研究中可重點關(guān)注。

現(xiàn)代研究表明，多糖具有多種藥理作用[19－20]，如抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、抗輻射、降血糖、調(diào)血脂、美容等。總多糖的常用含量測定方法為苯酚－濃硫酸比色法[21－22]，簡單易行，結(jié)果穩(wěn)定，線性關(guān)系良好。本次馬卡列丙預試驗中，初步確定了其可能含有的化學組分，為其有效成分的提取、分離、純化及藥物開發(fā)研究提供了科學依據(jù)，為進一步開發(fā)利用提供了試驗參考依據(jù)。