雙黃連片高效液相色譜指紋圖譜的建立及聚類分析和主成分分析

唐佩琴

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院藥學科，福建 福州 350000）

雙黃連片由連翹、黃芩、金銀花3 味藥材按2 ∶1 ∶1的處方配比制備而得，具有疏風解表、清熱解毒之功效，臨床用于治療外感風熱所致感冒[1]，收載于2015年版《中國藥典（一部）》。現行質量標準分別采用3 種不同的色譜條件和不同的樣品前處理來檢測黃芩苷、綠原酸及連翹苷3 種成分的含量，操作煩瑣。目前，已有關于雙黃連制劑包括口服液、顆粒劑、粉針劑等劑型的質量控制分析[2－4]，但鮮有雙黃連片的多成分質量控制。中藥制劑是多種藥材的內在多活性成分多靶點協同起效，僅對單一成分定量分析并不能準確判斷其質量和療效。中藥指紋圖譜可系統、科學、全面、綜合地反映中藥復方制劑的整體性，是一種半定量鑒別技術，強調對圖譜共有峰歸屬的辨識和圖譜相似性評價，已成為國際認可化的質量評價模式，廣泛應用于中藥產品質量一致性和穩定性評價。主成分分析法是將指紋圖譜中的多指標信息轉換成綜合指標，達到簡化綜合分析的目的[5－7]。本研究中共收集了2 個不同生產廠家12 批次雙黃連片，建立了高效液相色譜指紋圖譜，共確定18 個共有峰，并采用聚類分析及主成分分析法考察雙黃連片的質量特征，確定引起質量差異的特征色譜峰，為系統評價雙黃連片的質量提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 型高效液相色譜儀，包括G1311A 四元梯度泵、G1329A 自動進樣器、G1314BDAD 檢測器、G1316A 柱溫箱、Agilent－Chemistation 數據處理系統（安捷倫科技有限公司）；AUW－220D 型電子天平（美國島津公司，精度為0.01 mg）；KQ－250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）；Milli－QAcademic 型超線水系統（默克密理博公司）。

試藥：雙黃連片（編號S1 ～S5，哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批號分別為20180611，20180907，20181105，20181211，20190122；編號S6 ～S12，藥都制藥集團股份 有限公司，批號分別為190103，190212，190317，190425，190521，190602，190705）；綠原酸對照品（批號為110753－201817，含量為96.8%），木犀草苷對照組（批號為111720－201609，含量為94.9%），連翹酯苷A對照品（批號為111810－201707，含量為97.2），連翹苷對照品（批號為110821－201816，含量為95.1%），黃芩苷對照品（批號為110715－201821，含量為95.4%），漢黃芩苷對照品（批號為112002－201702，含量為98.5%），黃芩素對照品（批號為111595－201607，含量為98.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（批號為AS184407），甲醇（批號為MS1923814）均為色譜純，均購自美國Merck 公司，甲酸（分析純，批號為20190517，西隴科學股份有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果[8 －10]

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.07%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～12 min 時8% →16%A，12 ～20 min 時16% →25%A，20 ～26 min 時25% →30%A，26 ～33 min 時30%→35%A，33 ～42 min 時35%→55%A，42 ～46 min時55%A，46 ～68 min 時55%→75%A）；分段切換波長：320 nm（0 ～32 min，綠原酸和木犀草苷），220 nm（32 ～46 min，連翹酯苷A 和連翹苷），275 nm（46 ～68 min，黃芩苷、漢黃芩苷及黃芩素）；流速：0.9 mL／min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；色譜記錄時間：68 min。

2.2 溶液制備

取綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷對照品各適量，精密稱定，用60%甲醇溶液溶解并配制成每1 mL 含綠原酸0.037 5 mg、木犀草苷0.087 9 mg、連翹酯苷A 0.288 5 mg、連翹苷0.143 6 mg、黃芩苷0.134 7 mg、漢黃芩苷0.108 2 mg、黃芩素0.066 4 mg 的混合對照品溶液，避光、冰箱冷藏保存，備用。取樣品20 片，研細，取約1.0 g，精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入60%甲醇溶液35 mL，恒溫超聲處理（功率為450 W，頻率為40 kHz）45 min，取出，放冷，加60%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取同一混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續進樣6 針（每針10 μL），記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 為參比峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD＜1.2%（n ＝6），相對峰面積的RSD＜2.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為20181211）樣品，依法制備供試品溶液，在室溫放置0，3，6，9，12，18，24 h時按擬訂色譜條件進樣分析，記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 峰為參比峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD＜1.8%（n ＝6），相對峰面積的RSD＜2.0% （n＝6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20181211）樣品，依法制備供試品6 份，研細，過篩（80 目），取細粉，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄指紋圖譜，以連翹酯苷A 為參比峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD＜1.3%，相對峰面積的RSD＜2.5% （n＝6），表明方法重復性良好。

2.4 高效液相色譜指紋圖譜的建立

取樣品（編號S1 ～S12），研細，過80 目篩，取細粉，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，采用2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》以下簡稱《評價系統》對12 份指紋圖譜進行分析。結果見圖1。

2.5 相似度評價分析

采用《評價系統》，以供試品高效液相色譜指紋圖譜為參照，進行整體相似度評價。結果來自2 個廠家的12批供試品溶液的指紋圖譜相似度為0.913 ～0.984，表明各批次間各成分含量存在差異。結果見表1。

2.6 共有峰指認

12 批供試品溶液高效液相色譜指紋圖譜中共確定18 個共有峰，與圖1 C 比對，指認出7 個成分，8 號峰為綠原酸、12 號峰為木犀草苷、13 號峰為連翹酯苷A、14號峰為連翹苷、16 號峰為黃芩苷、17 號峰為漢黃芩苷和18 號峰為黃芩素。比對色譜峰相對保留時間和分離度等因素，發現保留時間34.22 min 處的13 號峰位置適中，與前后色譜峰分離完全，且信號強度最大，故選擇13 號峰（連翹酯苷A）為參照，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積及其RSD。結果見表2。

2.7 聚類分析[11 －12]

將12 批樣品18 個共有峰的相對峰面積數據導入SPSS 22.0 統計學軟件，采用離差平方和法（Ward 法），以歐氏距離平方（SED）為測度，采用系統聚類分析法進行模式識別分析。結果見圖2。根據聚類分析樹狀圖，類間距離為5 時，12 批樣品被分成了兩大類：樣品S1 ～S5與對照指紋圖譜相似度小于0.94，樣品S6 ～S12 與對照指紋圖譜相似度大于0.95。可見，聚類分析結果與相似度結果基本一致，同一廠家聚為一類，不同廠家的產品所含成分存在差異，而同一廠家各成分含量均勻、穩定，可能與廠家藥材來源、采收和生產加工工藝有關。

圖1 高效液相色譜指紋圖譜

表1 12 批雙黃連片樣品相似度評價結果

表2 12批樣品高效液相色譜指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積

圖2 12 批樣品聚類分析樹狀圖

2.8 主成分分析[13 －14]

以指紋圖譜中18 個共有峰的峰面積為變量，構建19×18 的原始數據矩陣，采用SPSS 22.0 統計學軟件對12 批樣品主成分進行分析。結果見表3 和表4。可見，提取的2 個主成分特征值均大于1，且累計方差貢獻率達92.242%，2 個主成分足以解釋18 個共有峰的主要特征和信息。主成分1 主要反映綠原酸、木犀草苷、連翹酯苷A、連翹苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷的信息，峰9、峰11、峰15 對主成分2 貢獻率較大。

表3 2 個主成分的特征值及方差貢獻率

表4 初始因子載荷矩陣

3 討論

3.1 測定目標成分選擇

雙黃連片處方中連翹、金銀花和黃芩的用量比為2 ∶1 ∶1，連翹具有抗菌、強心、利尿等藥理作用，主要含有連翹酯苷、連翹苷、齊墩果酸及揮發油等成分。其中，連翹脂苷是連翹中最主要的抗菌活性成分[15]，也是雙黃連片主要的質控指標成分之一。黃芩具有瀉火、除濕熱的功效，是涼血解毒、清熱燥濕的要藥，故選取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等黃酮類化合物作為制劑中黃芩藥材的質控指標[16]。金銀花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱作用，特征成分綠原酸和木犀草苷在高效液相色譜圖中可清晰分辨[17]。

3.2 色譜條件選擇

采用DAD 檢測器在190 ～400 nm 波長紫外光區對對照品溶液進行了全波長掃描；考察了乙腈－水、甲醇－水、乙腈－磷酸水、甲醇－磷酸水、乙腈－甲酸溶液、甲醇－甲酸溶液流動相系統不同梯度洗脫條件；對Shimadzu VP－ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Zorbax－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行了優選；篩選0.6，0.8，0.9，1.0，1.2 mL ／ min 的流速，以及柱溫25，30，35 ℃。最終按擬訂色譜條件進樣，各色譜峰信息最多，各成分分離情況良好，可用于雙黃連片的指紋圖譜分析。

本研究中建立的雙黃連片高效液相色譜指紋圖譜，提取到18 個共有峰，以13 號峰（連翹酯苷A）為參照峰，計算其他各共有峰的相對峰面積，并進行了聚類分析和主成分分析。利用降維思想，將較多原始變量綜合成較少變量的主成分分析，能系統、客觀地反映出其內在質量信息及引起不同批次雙黃連片差異的主要原因，方法簡便、實用，可作為評價雙黃連片質量的參考依據。