3，5－二硝基水楊酸法測定蔓菁中還原糖和總糖含量*

高文軍，李衛(wèi)紅，王喜明，喬麗芳

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006）

蔓菁Brassica rapaL. 為十字花科蕓薹屬植物蔓菁的根，具有開胃消食、下氣寬中、止咳化痰、利濕解毒、溫和脾胃之功效[1]。其根富含多種糖類[2－3]、有機(jī)酸、甾體、三萜、生物堿[4]等化合物，以及核黃素、煙酸、維生素C及鈣、磷、鐵[5]等無機(jī)元素，具有抗缺氧、提高免疫力[6]、抗輻射、滋補(bǔ)等功效。蔓菁在新疆、西藏、四川、陜西、山西等地多有種植。《食療本草》《本草綱目》《千金方》《本草從新》《名醫(yī)別錄》《藥物寶庫》等古代文獻(xiàn)均有記載，其中《本草綱目》有“辛、苦、平，無毒，可升可降，能汗能吐，能下能利小便，又能明目解毒，其效甚偉”的描述。蔓菁的藏藥名為“妞瑪”，具有解毒、滋補(bǔ)功效，主治各種中毒癥、“龍”病、身體虛弱等；維吾爾族名為“恰瑪古”，是維吾爾族人喜愛并有較長歷史的藥食同源之品，且以藏藥、維藥的形式收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中[7]。山西晉南地區(qū)出產(chǎn)的蔓菁應(yīng)用廣泛，在當(dāng)?shù)匾延猩习倌甑氖秤脷v史，其形似人參，在當(dāng)?shù)赜小靶∪藚ⅰ敝Q。對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究有助于進(jìn)一步開發(fā)利用該產(chǎn)品，為當(dāng)?shù)芈假Y源的利用提供依據(jù)。目前，僅對(duì)晉南蔓菁化學(xué)成分分析及蛋白質(zhì)含量測定有報(bào)道[8]，此外未見其他文獻(xiàn)對(duì)晉南蔓菁有研究。晉南蔓菁多糖含量較多，而植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗氧化、降血糖等作用[9]。為此，本研究中建立了測定晉南蔓菁中糖含量的方法，為蔓菁的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Biomate 3S 型紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司）；AUW220D 型電子天平（Shimadzu 公司，精度為十萬分之一）；WB－4 型恒溫水浴鍋（常州崢嶸儀器有限公司）；SB－500DTY 型超聲波多頻清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；XF－100 型粉碎機(jī)（江蘇杰瑞爾電器有限公司）；Vortex－2 型渦旋混勻儀（上海滬析實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

蔓菁（采自山西運(yùn)城，批號(hào)分別為20181220，20181230，20190105）；D－無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833－201205，含量不低于99.5%）；鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），3，5－二硝基水楊酸（上海科豐化學(xué)試劑有限公司），苯酚（天津市申泰化學(xué)試劑有限公司），均為分析純；DNS 試劑（將6.9 g 結(jié)晶重蒸餾酚溶于15.2 mL 10%氫氧化鈉溶液中，稀釋至69 mL 后加入6.9 g 亞硫酸氫鈉，作為A 液；將255 g 酒石酸鉀鈉加入300 mL 10%氫氧化鈉溶液中，再加入880 mL 1%3，5－二硝基水楊酸溶液，作為B 液；將A液、B 液混合，得黃色溶液，貯于棕色瓶中備用，常溫下放置1 周后使用[10]）；其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對(duì)照品貯備溶液：精密稱取D－無水葡萄糖對(duì)照品8.53 mg，用水溶解并定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液（質(zhì)量濃度為0.849 mg／mL）。

還原糖供試品溶液：取樣品粉末（過20 目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，取出，放至室溫，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

總糖供試品溶液：取樣品粉末（過20 目篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞刻度大試管中，加6 mol／L 鹽酸10 mL，沸水浴水解10 min，取出，流水冷卻至室溫，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，加蒸餾水至25 mL，搖勻，過濾，精密移取濾液1 mL 置5 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 樣品含量測定方法

精密量取以上還原糖供試品溶液、總糖供試品溶液各2 mL，置25 mL 具塞刻度大試管中，空白對(duì)照組加蒸餾水至2 mL，各加入2 mL DNS 試劑，搖勻，90 ℃水浴顯色6 min，取出，流水冷卻至室溫，加水至25 mL，搖勻，于540 nm 波長處檢測吸光度。

2.3 檢測條件確定

檢測波長：采用DNS 法測定時(shí)波長的選擇方法不一，但多集中在400 ～800 nm[11－13]。考慮到顯色劑、紫外分光光度計(jì)相關(guān)因素的影響，本研究中對(duì)DNS 法測定還原糖含量的最佳波長進(jìn)行了篩選，在400 ～800 nm 波長范圍內(nèi)對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行了掃描。精密量取稀釋的對(duì)照品貯備溶液和蒸餾水各2.0 mL，分別置25 mL 具塞試管中，各加入2 mL DNS 試劑，搖勻，90 ℃水浴加熱6 min，迅速冷卻，加水定容至25 mL，分別于400 ～800 nm 波長范圍內(nèi)對(duì)葡萄糖顯色液（以蒸餾水為空白對(duì)照）、DNS試劑（以蒸餾水為空白對(duì)照）、葡萄糖顯色液（以DNS 試劑為空白對(duì)照），確定檢測波長。結(jié)果見圖1。可見，葡萄糖顯色液（以DNS 試劑為空白對(duì)照）曲線最大吸收峰處的波長為490 nm，但在此波長下DNS 也具有一定的吸光度，選擇490 nm 波長對(duì)樣品的測定干擾較大。由另外2 條曲線可見，DNS 試劑以水為空白對(duì)照時(shí)，在低波長處自身的吸收較明顯，但隨著波長的增大吸收越來越小，當(dāng)波長不短于540 nm 時(shí)，葡萄糖顯色液（以DNS 試劑為空白對(duì)照）曲線和葡萄糖顯色液（以蒸餾水為空白對(duì)照）曲線近乎重合。可見，當(dāng)波長不短于540 nm 時(shí)，DNS 試劑自身的吸收對(duì)葡萄糖顯色液的干擾可忽略，故將540 nm 作為檢測波長。

圖1 葡萄糖溶液吸收光譜圖

顯色劑用量：分別精密量取2 mL 還原糖供試品溶液，置編號(hào)為1 ～6 號(hào)的25 mL 具塞試管中，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL DNS 試劑，沸水浴中加熱10 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度。結(jié)果見圖2 A。可見，當(dāng)DNS 試劑用量為2mL 時(shí)，用量繼續(xù)增加，吸光度浮動(dòng)較小。為了減小DNS 試劑對(duì)吸光度測定的影響，用量不應(yīng)小于2.0 mL，故本試驗(yàn)中DNS 試劑用量選擇2.0 mL。

顯色時(shí)間：分別精密量取2 mL 還原糖供試品溶液，置編號(hào)為1 ～5 號(hào)的25 mL 具塞試管中，分別加入2.0 mL DNS 試劑，沸水浴分別加熱4，6，8，10，12 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，在540 nm 波長下測定吸光度。結(jié)果見圖2 B。可見，沸水浴顯色4，6，8，10，12 min 時(shí)的吸光度變化不明顯，較穩(wěn)定；當(dāng)顯色時(shí)間長于4 min 時(shí)，顯色時(shí)間對(duì)于試驗(yàn)的影響不明顯。考慮到4 min 時(shí)間過于短暫，顯色時(shí)間過短操作較局促，故本試驗(yàn)中最終選擇6 min 為顯色時(shí)間。

顯色溫度：分別精密量取2 mL 還原糖供試品溶液5 份，置編號(hào)為1 ～5 號(hào)的25 mL 具塞試管中，分別加入2.0 mL DNS 試劑，分別在60，70，80，90，100 ℃水浴中加熱6 min，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，在540 nm 波長下測定吸光度。結(jié)果見圖2 C。可見，顯色溫度達(dá)90 ℃時(shí)，結(jié)果趨于穩(wěn)定，故本試驗(yàn)中選擇90 ℃為顯色溫度。

總糖水解時(shí)間：分別取蔓菁粉末（過20 目篩）6 份，每份約0.1 g，精密稱定，置編號(hào)為1 ～5 號(hào)的具塞刻度大試管中，加6 mol ／ L 鹽酸10 mL，分別沸水浴水解5，10，20，30，40 min，取出，流水冷卻至室溫，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，加水至25 mL，搖勻，過濾，精密量取濾液1 mL，置5 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得總糖供試品溶液，按擬訂檢測方法測定。結(jié)果見圖2 D。可見，水解時(shí)間為10 min 時(shí)吸光度最高，10 min 后吸光度開始下降，趨勢圖同文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，猜測可能水解液又發(fā)生了新的反應(yīng)，故本試驗(yàn)中選擇10 min 為總糖的水解時(shí)間。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密吸取對(duì)照品貯備溶液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00 mL，置5 mL 容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度溶液。精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置具塞刻度大試管中，加入2 mL DNS 試劑，搖勻，90 ℃水浴顯色6 min，取出，流水冷卻至室溫，加水至25 mL，搖勻，在540 nm 波長處檢測吸光度。以質(zhì)量濃度（C，mg／mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝1.112 7C＋0.019 1，r＝0.998 9（n＝5）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.042 45 ～0.509 4 mg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖2 檢測條件考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：分別取蔓菁原料的還原糖、總糖供試樣品溶液，按樣品測試方法連續(xù)測定6 次，記錄吸光度。結(jié)果還原糖的吸光度分別為0.300 4，0.300 4，0.300 4，0.300 5，0.300 5，0.300 5，總糖的吸光度分別為0405 6，0.405 7，0.405 3，0.405 2，0.405 6，0.406 1，還原糖和總糖的RSD分別為0.02%和0.08%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取蔓菁原料的還原糖、總糖供試樣品溶液，按樣品測定方法測定，顯色反應(yīng)完成后，每隔10 min 測定1 次。結(jié)果見表1，表明樣品在50 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別制備6 份蔓菁原料的還原糖、總糖供試品溶液，按樣品測試方法測定，記錄吸光度，并計(jì)算含量。結(jié)果還原糖平均含量為6.29% 、RSD為1.13% （n ＝6），總 糖 平 均 含量 為44.51% 、RSD為2.06%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（ n ＝6）

加樣回收試驗(yàn)：分別稱取6 份還原糖、總糖蔓菁樣品，每份約0.05 g，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入無水葡萄糖對(duì)照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂樣品測試方法測定，記錄吸光度，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

2.5 樣品含量測定

取3 批次樣品，按擬訂樣品測定方法測定還原糖和總糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算蔓菁樣品中還原糖和總糖含量。結(jié)果見表3。可見，晉南蔓菁還原糖和總糖的百分含量分別為5.86% ～6.93%，44.65% ～46.50%，還原糖和總糖含量均較高。由于糖類成分在晉南蔓菁中占比較高，不同的糖對(duì)人體有重要的生理作用，為下一步研究糖的組成和活性奠定了基礎(chǔ)。

表3 3 批樣品含量測定結(jié)果（%）

3 討論

測定樣品中糖的含量經(jīng)常采用的方法有苯酚－硫酸法[15]、蒽酮－硫酸法[16]、3，5－二硝基水楊酸（DNS）法[17]，但前2 種方法用的硫酸腐蝕性較強(qiáng)，會(huì)造成一定的安全隱患。另外，前2 種方法不能對(duì)樣品中單糖進(jìn)行測定，有一定局限性。DNS 法是半微量定糖法[18]，該方法操作簡單、便捷、雜質(zhì)干擾較少，便于批量測定，是一種常用方法。該方法的原理是在堿性條件下，還原糖將3，5－二硝基水楊酸中的硝基還原成氨基，生成橘紅色化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖含量與顏色成正比。本研究中同時(shí)考察了DNS 試劑用量、顯色溫度和反應(yīng)時(shí)間，保證了反應(yīng)的可靠性。經(jīng)方法學(xué)考察，DNS 法重復(fù)性好、操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于測定晉南蔓菁中多糖的含量。