6 種中藥飲片微生物檢測狀況分析*

李 艷，周 劍，劉 霞，朱照靜

（1. 重慶醫藥高等?？茖W校，重慶 401331； 2. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；3. 重慶市綦江區人民醫院，重慶 401420）

2015年版《中國藥典》首次收載中藥飲片的微生物限度標準，對研粉口服用貴細飲片、直接口服及泡服飲片規定了沙門菌、耐膽鹽革蘭陰性菌的限度，其他類型飲片暫無微生物控制要求。近年來，國家藥典委員會、各級藥品監督管理局及藥檢所等機構都相繼組織開展了中藥飲片的微生物限度檢測及相關課題研究[1－7]。熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉是中醫臨床常見可直接使用的中藥飲片，也是六味地黃丸、金匱腎氣丸等中藥制劑的處方成分。本研究中考察了重慶市最大中藥材批發市場銷售的以上6 種共36 批中藥飲片的微生物負載情況，為合理制訂中藥飲片微生物限度提供參考，同時為課題組后期開展微生物對六味地黃丸主要有效成分的影響作好前期工作?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：VITEK2 COMPACT 型全自動生化鑒定儀（生物梅里埃中國有限公司）；AⅡ型生物安全柜（上海力康生物醫療科技控股有限公司）；SHH150L 型生化培養箱（重慶四達試驗設備有限公司）；BX61 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）。

試藥：熟地黃共6 批，來源于重慶、河南；酒萸肉共6 批，來源于安徽、浙江、河北；牡丹皮共6 批，來源于安徽；山藥共6 批，來源于四川、河南；茯苓共6 批，來源于四川、云南、安徽；澤瀉共6 批，來源于四川、福建。樣品經重慶市食品藥品檢驗檢測研究院中藥室楊帆副主任藥師鑒定為正品。

培養基與菌株：胰酪大豆胨液體培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、腸道菌增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、RV 沙門增菌液體培養基及木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基，均購自中國食品藥品檢定研究院。

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白 色 念 珠 菌[CMCC（F）98001]、黑 曲 霉[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備[8]

根據2015年版《中國藥典（四部）》通則1107，制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的菌懸液、黑曲霉的孢子懸液。

1.2.2 供試液制備

取各批中藥飲片適量，無菌粉碎，稱取10 g，加滅菌胰酪大豆胨液體培養基至100 mL，使濃度為1 ∶10，備用。

1.2.3 微生物計數

取1.2.2 項下供試液，依次10 倍遞增稀釋至1∶10000，分別吸取1 ∶10 供試液及1 ∶100，1 ∶1 000，1 ∶10 000 稀釋級樣品勻液1 mL 置平皿中，每個稀釋級平行制備2 個平皿。同時，分別吸取1 mL 空白稀釋液置2 個平皿，作為空白對照。立即倒入46 ℃瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度[需氧菌采用胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）平板，培養溫度為33 ℃，培養5 d；霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）平板，培養溫度為25 ℃，培養7 d]培養，觀察結果。

另取1.2.2 項下供試液，置沸水浴30 min 后迅速冷卻，依次10 倍遞增稀釋至1 ∶10 000，分別吸取各稀釋級樣品勻液1 mL 置平皿中，每個稀釋級平行制備2 個平皿。立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基，凝固后，33 ℃培養5 d，測定耐熱菌數。

1.2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌

分別取1 ∶10 供試液及1 ∶100，1 ∶1 000 稀釋級樣品勻液1 mL，接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，35 ℃培養48 h，取上述培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基上，35 ℃培養24 h。同時取稀釋液1 mL 置10 mL 腸道菌增菌液體培養基中，與樣品平行試驗，做陰性對照，觀察結果。

1.2.5 沙門菌

取各粉碎后的供試品10 g，置200 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，35 ℃培養24 h，取上述培養物0.1 mL接種于10 mL RV 沙門增菌液體培養基中，35 ℃培養48 h，分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養基平板，35 ℃培養72 h，觀察結果。

陽性對照：取各粉碎后的供試品10 g，加入沙門菌[CMCC（B）50094]1 mL（含菌量約10 ～100 cfu／mL），與樣品平行試驗，觀察結果。

陰性對照：取稀釋液10 mL，置200 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，與樣品平行試驗，觀察結果。

1.2.6 菌落鑒定

挑取需氧菌總數項下TSA 平板生長單個菌落，劃線于TSA 平板，35 ℃培養24 h，備用，待檢。取沙門菌檢查項下胰酪大豆胨液體培養基培養物，劃線于TSA 平板，35 ℃培養24 h，挑取上述平板單個菌落，劃線于TSA 平板，35 ℃培養24 h，備用，待檢。將上述備用待檢平板培養物，采用生物梅里埃VITEK2 COMPACT 全自動生化鑒定儀進行分析，確認污染菌種類。

1.2.7 統計學處理

原始數據轉換為對數值，以對數值表示，采用SPSS 17.0 統計學軟件進行分析。

2 結果

2.1 需氧菌總數計數結果

6 種飲片共36 批樣品的TAMC 檢查結果見表1。可見，36 批飲片樣品的總體平均lgTAMC 值為1.7，最小值為0.5，最大值為3.2，表明飲片樣品的TAMC 整體水平滿足《歐洲藥典》[9]、《美國藥典》[10]和《日本藥典》[11]關于中藥飲片微生物限度的標準要求。以飲片樣品名稱為橫坐標、lg TAMC 值為縱坐標作箱式圖，結果見圖1?？梢?，6 種飲片中，牡丹皮的總體數值最高，污染水平較高；澤瀉、熟地黃、酒萸肉的整體污染水平較牡丹皮低，推測應與其炮制方式有關；茯苓和山藥的總值最低，且數值分布均較窄，表明這2 個品種污染水平低，且均勻性較好，質量較穩定。

表1 飲片樣品的TAMC 檢查結果

圖1 飲片樣品lgTAMC 箱式圖

2.2 霉菌和酵母菌總數計數

6 種飲片的霉菌和酵母菌總數計數平均結果均低于10 cfu／g，故未單獨進行列表和作圖。結果表明，6 種飲片的TYMC 負載均較低，滿足《歐洲藥典》《美國藥典》《日本藥典》的要求。檢驗結果較預期偏低，可能與該6 種飲片的性質與炮制方式有關，也可能與中藥飲片生產廠家為了降低微生物數量及活性，生產過程中采用射線輻照等方式進行滅菌處理相關。

2.3 耐熱菌數計數（NAIRE）

6 種飲片共36 批樣品，總體平均lgNAIRE 值為1.1，最小值為0.5，最大值為2.3，詳見表2。由表1 和表2 可見，經沸水浴熱處理30 min 后需氧菌負載均比未熱處理時小，但均能檢出需氧菌，提示中藥飲片即使經煎煮后也仍存在微生物污染的風險。以飲片樣品名稱為橫坐標、lgNAIRE 值為縱坐標作箱式圖，結果見圖2?？梢姡档てず蜐蔀a的lgNAIRE 值較表1 和圖1 中lgTAMC 值明顯降低，表明經煎煮后，可殺滅牡丹皮和澤瀉中相當部分的需氧菌。熟地黃、酒萸肉、茯苓、山藥的lgNAIRE 降低則不如前兩者明顯，分析原因可能是因為熟地黃、酒萸肉飲片在炮制過程中已用高溫蒸制，故煎煮后需氧菌負載變化不明顯；而茯苓和山藥需氧菌負載均較低，故煎煮后變化也不明顯。

表2 飲片樣品的耐熱菌檢查結果

圖2 飲片樣品lgNAIRE 箱式圖

2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌

耐膽鹽革蘭陰性菌計數結果（N）＜10 cfu ／ g 以lg 值0.5 計，10 cfu／g ＜N＜102cfu／g 以lg 值1.5 計，102cfu／g ＜N＜103cfu／g 以lg 值2.5 計，以此類推。以飲片樣品名稱為橫坐標、N轉化值為縱坐標作箱式圖，結果見圖3。6 種飲片中，牡丹皮與茯苓檢出耐膽鹽革蘭陰性菌計數均為N＜10 cfu／g，其余4 種飲片僅有熟地黃和酒萸肉各有1 批次為102cfu／g ＜N＜103cfu／g，均值為10 cfu／g ＜N＜102cfu／g，檢查結果符合2015年版《中國藥典（四部）》通則1107 中對中藥提取物控制菌的規定[8]。

圖3 飲片樣品耐膽鹽革蘭陰性菌箱式圖

2.5 沙門菌

所有樣品均未檢出沙門菌。

2.6 樣品含微生物種類鑒定情況

按1.2.6 項下操作，牡丹皮中檢出玫瑰色庫克菌、緩慢葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌、放射根瘤菌；澤瀉中檢出淺綠氣球菌、緩慢葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌、放射根瘤菌；熟地黃中檢出泛菌屬，酒萸肉中檢出淺綠氣球菌；茯苓中檢出產色葡萄球菌；山藥中檢出泛菌屬、緩慢葡萄球菌、少動鞘氨醇單胞菌。上述微生物主要為自然環境和人體中常見的微生物，在藥品生產、運輸、保存過程中，進行微生物污染種類分析，常能分離檢出，其中淺綠氣球菌常于醫院環境分離檢出，推測為特殊污染批次。

3 討論

參照2015年版《中國藥典（四部）》非無菌藥品微生物限度標準關于中藥飲片檢驗項目、限度標準相關規定，按非無菌藥品微生物計數及控制菌檢查法進行檢測，結果符合《歐洲藥典》《美國藥典》《日本藥典》及現行《中國藥典》同類標準的規定。

6 種飲片36 批樣品中，牡丹皮和澤瀉需氧菌總數相對較高，熟地黃和酒萸肉居中，茯苓和山藥較低；6 種飲片的霉菌和酵母菌總數計數平均結果均較低；經煎煮后，牡丹皮和澤瀉需氧菌總數降低最明顯，熟地黃、酒萸肉、茯苓和山藥前后變化較小。分析6 種飲片的炮制方式，熟地黃和酒萸肉在炮制過程中均有高溫蒸制過程，故飲片在煎煮前后需氧菌負載變化不明顯；牡丹皮和澤瀉則無高溫蒸制過程，故飲片在煎煮前后需氧菌負載變化較明顯；而茯苓和山藥則可能因為污染水平低，質量較穩定，故煎煮前后需氧菌負載均較低。耐膽鹽革蘭陰性菌整體檢出水平均較低，沙門菌均未檢出。分離鑒定出的其他微生物為自然環境和人體中常見的微生物種類。

6 種飲片36 批樣品中，所檢出微生物數量較預期偏低。除飲片炮制工藝因素外，還可能是一些生產廠家在生產過程中采用射線輻照等方式進行滅菌處理，造成樣品中微生物數量、活性大幅降低，導致檢出結果較預期偏低。

中藥飲片種類繁多、來源多樣、用途不同、加工工藝不同，不同地區中藥飲片的微生物負載差異也較大，對于中醫臨床使用和制劑生產使用的中藥飲片，應根據飲片性質、不同入藥部位、不同炮制方式、不同給藥途徑等分類制訂合適的微生物限度標準。本課題組的下一步工作將考察微生物對以上6 種中藥飲片有效成分的影響，為《中國藥典》進一步制訂中藥飲片微生物限度的補充提供參考。