高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿中芍藥苷和甘草酸銨含量

余中霞，方菲菲，張繼紅，何亞芬

（江西省上饒市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 上饒 334000）

養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿是由當(dāng)歸、白芍、熟地黃、茯苓、甘草、 黨參、黃芪、川芎8 味中藥組方的成方制劑，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》（WS3－B－0358－90），具有補(bǔ)氣血、調(diào)經(jīng)功效，臨床常用于治療行經(jīng)腹痛、月經(jīng)不調(diào)、貧血虛弱、產(chǎn)后體虛、產(chǎn)后血虛、萎黃肌瘦等癥。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下尚未收錄其含量測(cè)定指標(biāo)和方法。有研究以主藥當(dāng)歸和白芍中主要成分阿魏酸和芍藥苷為指標(biāo)成分建立含量測(cè)定方法，以及對(duì)主要成分當(dāng)歸、川芎、黃芪建立薄層色譜鑒別方法[1－2]。鑒于中藥成方制劑成分的復(fù)雜多樣性，少數(shù)成分難以全面評(píng)價(jià)和反映藥物的內(nèi)在質(zhì)量。且復(fù)方中甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效，是養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿制劑發(fā)揮藥效的主要臣藥，其主要成分為甘草苷和甘草酸[3－5]。本研究中以白芍中的芍藥苷、甘草中的甘草酸銨為指標(biāo)成分，建立了測(cè)定養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿中芍藥苷和甘草酸銨含量的高效液相色譜（HPLC）法，為進(jìn)一步提高和完善養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），包括Waters 2998PDA 檢測(cè)器，Empower3 工作站；BP211D 型電子天平（德國(guó)Sartoriu，精度為十萬(wàn)分之一）；色譜柱：Kromasil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司）；Bcf－20L 型數(shù)控超聲清洗器（上海比朗儀器制造有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；A3s－10－10CE 型超純水機(jī)（美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司）。

1.2 試藥

甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)為110731－201619），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736－200408），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均不低于98%；養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿（批號(hào)分別為170601，170506，江西盛翔制藥有限公司；批號(hào)171205，180504，180903，江西藥都樟樹(shù)制藥有限公司；批號(hào)為20161202，廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)為170602，福壽堂制藥有限公司）；乙醇（分析純，上海展云化工有限公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；磷酸（色譜純，上海展云化工有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.085%磷酸溶液，洗脫梯度程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（% ）

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取芍藥苷對(duì)照品10.49 mg、甘草酸銨對(duì)照品18.45 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL 棕色容量瓶中，加70%乙醇適量溶解并定容至刻度，混勻，即得。

供試品溶液：精密量取樣品6 mL，置10 mL 棕色容量瓶中，加入70%乙醇適量，密塞，超聲提取20 min（功率為40 W，頻率為50 Hz），放冷，再用上述溶液補(bǔ)至刻度，搖勻，離心30 min（轉(zhuǎn)速為4 000 r ／ min，功率為25 W），取上清液，過(guò)濾，濾液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按該制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的處方和制備工藝制備缺白芍和甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別精密吸取上述3 種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件分析，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果被測(cè)成分能達(dá)到完全分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液1，2，3，4，5 mL，分別置25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y芍＝11 929X＋19 597（r＝0.999 2）和Y甘＝3 654X－10 667（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，芍藥苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別在5.54 ～55.35 μg／mL 和9.63 ～115.56 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一混合對(duì)照溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)定其峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果芍藥苷和甘草酸銨的RSD分別為0.21%和0.16%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同批（批號(hào)為170601）樣品，依法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果芍藥苷和甘草酸銨含量的RSD分別為0.49%和0.56% （n＝6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批（批號(hào)為170601）樣品，依法制備供試品溶液6 份，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果芍藥苷和甘草酸銨含量的RSD分別為0.62% 和0.54%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取6 mL 同批（批號(hào)為170601）樣品，分別置10 mL 容量瓶中，平行6 份，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批次樣品，每個(gè)批次平行3 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝6）

表3 7 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／mL，n ＝3）

3 討論

3.1 提取條件選擇

采用單因素分析法，比較了不同提取方法（加熱回流、冷浸提取、超聲提取）、不同提取溶劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯）、不同提取體積分?jǐn)?shù)（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇）、不同提取時(shí)間（15，30，45，60 min）的提取效果。結(jié)果表明，以70%乙醇溶液超聲提取30 min 提取最完全，所測(cè)含量最高，且操作簡(jiǎn)單便捷、環(huán)保安全。

3.2 流動(dòng)相選擇

有機(jī)相比較了甲醇和乙腈，結(jié)果在相同色譜條件下，以乙腈為有機(jī)相，目標(biāo)化合物能獲得更好分離。水相比較了0.1%磷酸溶液和0.085%磷酸溶液，結(jié)果表明，以0.085%磷酸溶液為水相，目標(biāo)化合物色譜峰出峰時(shí)間適宜且分離度和峰形均明顯優(yōu)于0.1%磷酸溶液。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇[6 －7]

比較了316，250，230 nm 波長(zhǎng)下芍藥苷和甘草酸銨的檢測(cè)情況，結(jié)果表明，以316 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到甘草酸銨；以250 nm 為吸收波長(zhǎng)時(shí)，2 種物質(zhì)未達(dá)到最大吸收峰；以230 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，2 種物質(zhì)均有吸收峰，峰面積值最大，故選擇230 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 結(jié)果分析

通過(guò)方法學(xué)考察，本試驗(yàn)中所建立的方法穩(wěn)定準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便易行，可為進(jìn)一步制訂和完善養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。不同廠家和不同批次的制劑含量測(cè)定結(jié)果表明，養(yǎng)血當(dāng)歸糖漿中芍藥苷和甘草酸銨的含量穩(wěn)定，表明制劑工藝穩(wěn)定，藥材來(lái)源可靠。