頂空氣相色譜法檢測(cè)他達(dá)拉非原料藥中4 種溶劑殘留量

張繼東，盧 江，張世應(yīng)，唐 靜，楊瑞玲，孫緒舉△

（1. 華中科技大學(xué)醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430074； 2. 湖北省武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430077）

他達(dá)拉非片是環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）特異性磷酸二酯酶5（PDE5）的選擇性可逆抑制劑[1－2]，可抑制PDE5，使陰莖海綿體內(nèi)cGMP 水平提高，平滑肌松弛，使血液流入陰莖組織，從而使其勃起。作為勃起功能障礙的治療藥物，他達(dá)拉非持續(xù)時(shí)間較西地那非更長(zhǎng)、耐受性更好，同樣對(duì)心血管、肺動(dòng)脈有擴(kuò)張作用，也可作為肺動(dòng)脈高壓的治療藥物。他達(dá)拉非有多條合成路線，合成中主要用到甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃等有機(jī)溶劑。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[3]并未收載他達(dá)拉非有機(jī)溶劑的檢測(cè)方法。因此，本研究中采用頂空氣相色譜技術(shù)[4－8]測(cè)定他達(dá)拉非原料藥中的甲醇、乙腈、異丙醇、四氫呋喃溶劑的殘留量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 氣相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)惠普公司）；Agilent 7890A 型氣相色譜儀配備頂空自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫公司）；XS205 型分析天平（瑞士梅特勒公司，精度為0.01 mg）；Milli－Q 型純水器（美國(guó)Milli Pore 科技公司）。

1.2 試藥

二甲基亞砜（DMSO，SIGMA 試劑有限公司，批號(hào)為C10268951）；甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)TEDIA 試劑公司）；異丙醇、四氫呋喃為分析純（國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑廠）；他達(dá)拉非原料藥（湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司，批號(hào)分別為171596－29－5，171596－29－6，171596－29－7）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DB－624 柱（30 m ×0.53 mm，3.0 μm）；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；分流比：5 ∶1；檢測(cè)器：FID，檢測(cè)器溫度為250℃；載氣：高純氮?dú)?，純度?9.999%；流速：1.8 mL ／min；程序升溫方式：初始溫度60 ℃，保持4 min，然后以20 ℃／min 的速率升至200 ℃，保持8 min；頂空瓶：平衡溫度為90 ℃，平衡時(shí)間為40 min，傳輸管溫度為100 ℃，定量環(huán)溫度為110 ℃。對(duì)照品溶液色譜圖中4 種殘留溶劑峰的理論板數(shù)均不低于5000，且分離度均大于1.5。

2.2 溶液制備

對(duì)照品貯備液：取甲醇300 mg、乙腈41 mg、異丙醇300 mg、四氫呋喃72 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液：精密量對(duì)照品貯備液1，2.5，5，10，20，25 mL，分別置50 mL 容量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。臨進(jìn)樣前精密量取系列對(duì)照品溶液各5 mL，置20 mL 頂空瓶中密封，待進(jìn)樣。

供試品溶液：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入5 mL 二甲基亞砜使溶解，密封，即得。

空白溶液：精密移取5 mL 二甲基亞砜，置20 mL 頂空瓶中，密封，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：精密量取2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃主峰的保留時(shí)間處均無(wú)干擾峰。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：取對(duì)照品溶液，注入氣相色譜系統(tǒng)。以各殘留溶劑的峰面積響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃4 種溶劑的線性回歸方程。詳見表1。

表1 4 種溶劑殘留線性關(guān)系考察結(jié)果

檢測(cè)限與定量限確定：根據(jù)甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃4 種殘留溶劑的儀器響應(yīng)情況，逐步稀釋對(duì)照品溶液，以信噪比（S／ N）＝10 ∶1 對(duì)應(yīng)的濃度作為各溶劑的定量限，S／ N＝3 ∶1 對(duì)應(yīng)的濃度作為殘留溶劑的檢測(cè)限。4 種溶劑的檢測(cè)限及定量限見表2。

表2 4 種溶劑的檢測(cè)限與定量限（μg／mL）

重復(fù)性試驗(yàn)：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，同法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂氣相色譜條件頂空進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取供試品約0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，同法精密稱取6 份樣品，分別精密移取已知質(zhì)量濃度（甲醇0.6 mg／mL、乙腈0.082 mg／mL、異丙醇0.6 mg／mL 和四氫呋喃0.144 mg／mL）的對(duì)照品溶液各5 mL，置已預(yù)先加入0.5 g 樣品的20 mL 頂空瓶中，共配制3 個(gè)加標(biāo)濃度。按擬訂氣相色譜條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果見表4。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（%，n ＝6）

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n ＝3）

2.4 殘留溶劑含量測(cè)定

依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件頂空進(jìn)樣，測(cè)試3 批他達(dá)拉非樣品中的溶劑殘留量。結(jié)果3 批樣品均未檢出乙腈、異丙醇，其中2 批均有檢出甲醇和四氫呋喃，1 批只檢出甲醇；1 批次四氫呋喃超標(biāo)（《中國(guó)藥典（四部）》規(guī)定不超過0.072%），分析生產(chǎn)工藝可能由于樣品重結(jié)晶后烘干工藝不穩(wěn)定而導(dǎo)致樣品中殘留溶劑四氫呋喃超標(biāo)。詳見表5。

表5 殘留溶劑含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 溶劑篩選

用純化水溶解時(shí)，因他達(dá)拉非原料藥不溶于水，樣品浮于純化水上，待測(cè)溶劑不能很好地溶于純化水中，對(duì)樣品中甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃的檢測(cè)準(zhǔn)確性有一定影響，重復(fù)性也不符合2015年版《中國(guó)藥典（二部）》對(duì)殘留溶劑重復(fù)性的要求。本研究中采用二甲基亞砜溶劑溶解樣品，他達(dá)拉非樣品完全溶于二甲基亞砜，且4 種殘留溶劑的對(duì)照品溶液以二甲基亞砜作為溶劑，其穩(wěn)定性也比水更好。故選擇二甲基亞砜作為本次測(cè)試方法的溶劑。

3.2 程序升溫考察

考察了初始柱溫分別為50，60，70 ℃對(duì)各溶劑色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初始柱溫為50 ℃時(shí)，4 種溶劑出峰后移且乙腈和異丙醇分離度小于1.5；初始柱溫為60 ℃時(shí)，色譜峰峰型較好且分離度大于1.5；初始柱溫為70 ℃時(shí)甲醇峰出峰較早且拖尾嚴(yán)重。綜合考慮，初始柱溫設(shè)為60 ℃。

3.3 頂空進(jìn)樣條件考察

頂空瓶加熱溫度考察：保持其他頂空條件不變，分別考察頂空瓶保溫溫度為60，70，80，90，100 ℃時(shí)對(duì)待測(cè)溶劑測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果設(shè)定頂空瓶保溫溫度分別為60，70，80，90 ℃時(shí)，各溶劑峰面積逐漸增大，設(shè)定頂空瓶保溫溫度為100 ℃時(shí)，各溶劑峰面積與90 ℃時(shí)基本一致，故試驗(yàn)設(shè)定保溫溫度為90 ℃。

頂空瓶保溫時(shí)間考察：保持其他頂空條件不變，分別設(shè)定頂空瓶保溫時(shí)間為20，30，40，50，60 min 時(shí)對(duì)待測(cè)溶劑峰面積的影響。結(jié)果設(shè)定頂空瓶保溫時(shí)間分別為20，30，40 min 時(shí)，待測(cè)溶劑的峰面積逐漸增大；設(shè)定頂空瓶保溫時(shí)間分別為50，60 min 時(shí)，與40 min 對(duì)應(yīng)的待測(cè)溶劑峰面積基本一致，表明保溫時(shí)間設(shè)定在40 min內(nèi)不夠，未將樣品中待測(cè)溶劑完全分離出來(lái)，故試驗(yàn)設(shè)定頂空瓶保溫時(shí)間為40 min。

綜上所述，本研究中建立的測(cè)定他達(dá)拉非中甲醇、乙腈、異丙醇和四氫呋喃溶劑殘留量的檢測(cè)方法，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，且操作簡(jiǎn)便快速，可為他達(dá)拉非的質(zhì)量控制提供參考。