Nrf2激動劑EGCG對糖尿病傷口愈合障礙的治療作用研究①

李 迎 陳旭東 張?zhí)扃?于 淼 張吉林 宋玉國 (北華大學附屬醫(yī)院,吉林 132011)

糖尿病傷口愈合障礙(diabetic non-healing wound,DNHW) 是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高、致殘性大，對患者身心造成極大傷害、對社會造成巨大經(jīng)濟負擔。然而由于該疾病發(fā)病機制尚不明確，導致目前尚缺乏有效的治療手段。因此，闡明該疾病發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)有效治療靶點具有重要的理論意義和實用價值。DNHW的形成受多種因素影響，其中氧化應激是導致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要機制。在高血糖狀態(tài)下，細胞內ROS產(chǎn)生過多，導致一系列損傷性效應[1]。這些損傷性效應可引起炎癥因子釋放、細胞凋亡通路激活、細胞再生障礙、細胞外基質生成障礙、血流動力學改變等多種效應，最終導致皮膚組織結構重塑障礙[2]。由此可見，氧化應激是糖尿病誘導DNHW的重要機制。增強皮膚組織抗氧化能力、抑制糖尿病導致的皮膚高氧化應激狀態(tài)是防治DNHW的有效策略。核因子相關因子2[Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2,NFE2L2,Nrf2]是機體抗氧化系統(tǒng)的核心因子[3]。Nrf2是對抗DNHW的關鍵保護性因子，上調Nrf2抗氧化通路具有防治DNHW的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG) 是天然植物綠茶茶多酚最主要、有效的組成成分，其抗氧化應激作用已在多種疾病模型中被證實[4-7]。EGCG是強效Nrf2激動劑，可激活Nrf2抗氧化信號通路，啟動下游抗氧化基因血紅素加氧酶1(HO-1)和還原型輔酶/醌氧化還原酶1(NQO1)的表達。HO-1、NQO1蛋白作為抗氧化劑抑制糖尿病引起的皮膚細胞氧化應激損傷、炎癥因子釋放、細胞凋亡通路激活等過程，對組織、細胞起到保護作用[8-10]。因此，研究EGCG對DNHW的治療作用并探討相關機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 ICR品系小鼠，8周齡，體重為(20.05±1.50)g，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要試劑 鏈脲佐霉素(STZ)購自Sigma公司，用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)稀釋，50 mg STZ用該緩沖液稀釋至10 ml，終濃度為0.5 mg/100 μl。EGCG購自Sigma公司，用二甲基亞砜(DMSO)配制成3個濃度，即0.25 mg/100 μl、 0.5 mg/100 μl和1.0 mg/100 μl。

1.2方法

1.2.1小鼠糖尿病動物模型的建立 小鼠飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學院實驗動物室，給予嚙齒類動物標準飼料及高糖、高脂飼料按照實驗計劃進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為(25±1)℃，相對濕度(55±5)%，明亮-黑暗交替12 h∶12 h。腹腔注射STZ，50 mg/(kg·d)；若小鼠體重為20 g，即每天腹腔注射200 μl；連續(xù)5 d，每天給藥1次，制備小鼠糖尿病動物模型。2周后，用尾靜脈血檢測空腹血糖，空腹血糖≥13 mmol/L，為小鼠糖尿病動物模型造模成功。之后，這些糖尿病小鼠用高糖、高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)12周，定期檢測血糖，觀察尿量等相關指標，使之達到中晚期糖尿病狀態(tài)。

1.2.2糖尿病傷口愈合障礙模型的建立 小鼠糖尿病動物模型建模成功以后，建立糖尿病傷口愈合障礙模型。分為糖尿病組和正常對照組，糖尿病組為上述建立的糖尿病動物模型鼠，正常對照組為與糖尿病組周齡及相關條件具有可比性的正常小鼠。糖尿病組進一步分2組，正常對照組也分為2組，共4組同步進行實驗。上述各組小鼠，腹腔注射水合氯醛(0.3 mg/kg)麻醉，在小鼠左后背靠近尾部，人工制造直徑15 mm的皮膚創(chuàng)口。小鼠分籠飼養(yǎng)。用標尺進行標記，數(shù)碼相機拍照。觀察指標：創(chuàng)口愈合率。糖尿病組創(chuàng)口愈合率明顯低于正常對照組，且具有統(tǒng)計學意義，證明糖尿病傷口愈合障礙模型建模成功。

1.2.3Nrf2激動劑EGCG對糖尿病傷口愈合障礙的治療作用研究 糖尿病組16只小鼠，正常對照組16只小鼠，分為如下4組：糖尿病+DMSO(DM+DMSO)組；糖尿病+EGCG(DM+EGCG)組；正常對照+DMSO(Control+DMSO)組；正常對照+EGCG(Control+EGCG)組； 每組8只小鼠。DMSO為配制EGCG藥物的基質，在此為藥物空白對照，給藥量的體積與EGCG藥物相同。動態(tài)觀察創(chuàng)口的愈合效果，拍照并記錄創(chuàng)口直徑，記錄時間點為第0、2、4、6、8、10天。第10天拍照、記錄后采集皮膚。

1.2.4創(chuàng)口皮膚采集 上述程序結束后，全部實驗小鼠均用水合氯醛安樂死，根據(jù)殘留創(chuàng)面直徑大小，選用相應型號的環(huán)形皮膚活檢穿孔器采集皮膚。皮膚采集后，一部分浸泡于福爾馬林固定液中，固定后石蠟包埋備用；一部分用于新鮮組織的相關實驗。

1.2.5Western blot檢測 新鮮皮膚組織，用細胞裂解液處理，提取蛋白后，定量檢測。用Western blot試劑盒進行檢測。提取蛋白并定量，稀釋至工作濃度；用SDS-PAGE凝膠電泳；然后經(jīng)過轉膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影等步驟，完成Western blot實驗。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為Western blot蛋白質標準化內參，計算每個樣品目的蛋白的相對含量，統(tǒng)計分析組間各指標的差異。所用抗體如下：anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-NQO1、anti-ICAM-1、anti-VCAM-1和anti-Caspase12。以上抗體為Santa Cruz Biotechnology,應用時采用抗體稀釋液稀釋，1∶1 000。

1.2.6免疫組化實驗 石蠟包埋的皮膚組織切片(5 μm)制備用于免疫組化的白片。免疫組化(IHC)技術用于檢測3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)。IHC檢測試劑盒為MXB生物技術公司提供的試劑盒。用于IHC檢測的一抗抗體滴度為 1∶100。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0軟件對所得結果進行分析，各組間的參數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1小鼠糖尿病模型和傷口愈合障礙模型的建模結果及EGCG治療效果 小鼠腹腔注射STZ，連續(xù)5 d，每天給藥一次。2周后，用尾靜脈血檢測空腹血糖，糖尿病組小鼠的空腹血糖均≥13 mmol/L，證明小鼠糖尿病動物模型造模成功。

糖尿病組和正常對照組共32只小鼠全部進行背部創(chuàng)口，第0天的創(chuàng)口直徑均為15 mm，如圖1所示。通過對糖尿病組和正常對照組進行統(tǒng)計學分析顯示，糖尿病組傷口愈合率明顯低于正常對照組(P<0.01)，證明糖尿病傷口愈合障礙建模成功。在糖尿病小鼠中，EGCG治療組的傷口愈合率明顯高于非治療組(P<0.05)，證明EGCG對糖尿病傷口愈合障礙具有治療作用；在正常對照組中，EGCG治療組和非治療組的傷口愈合率無明顯差異(P>0.05)。皮膚創(chuàng)口愈合率曲線見圖2。

2.2EGCG治療DNHW過程中對Nrf2、炎癥因子及細胞凋亡的影響 應用Western blot技術對Nrf2、HO-1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白質相對表達量進行檢測，結果見圖3。Nrf2包括總Nrf2(t-Nrf2)和胞核Nrf2(n-Nrf2)。研究結果顯示，DM組的Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達量均低于Control組(P<0.05)；無論是糖尿病組還是正常對照組，創(chuàng)口應用EGCG的治療組Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達量均高于非治療組(P<0.05)。通過對ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白相對表達量進行統(tǒng)計分析證實，DM組高于Control組(P<0.05)；在DM組中，與非治療組比較，創(chuàng)口應用EGCG的治療組ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白的相對表達量明顯下降(P<0.05)；在正常對照組中，ICAM-1、VCAM-1和Caspase12等蛋白的相對表達量在EGCG治療組與非治療組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3EGCG治療DNHW過程中對皮膚氧化應激指標3-NT的影響 檢測3-NT可以準確反映皮膚組織的氧化應激狀態(tài)，也可以準確反映EGCG治療DNHW過程中皮膚氧化應激的改善，是考核治療效果的有效指標。免疫組化(IHC)技術檢測3-NT，結果見圖4。研究結果顯示，DM組3-NT陽性率明顯高于Control組，證明糖尿病機體皮膚傷口處于較高水平的氧化應激狀態(tài)；在糖尿病組中，應用EGCG的治療組3-NT陽性率明顯低于非EGCG治療組，證明EGCG有效降低了氧化應激；在正常對照組中，無論是否應用EGCG治療，3-NT陽性率都沒有明顯差異，且處于較低水平的氧化應激狀態(tài)。

圖1 皮膚創(chuàng)口動態(tài)觀察Fig.1 Dynamic observation of skin wound

圖2 皮膚創(chuàng)口愈合率曲線Fig.2 Curve of skin wound healing rate

圖3 EGCG對Nrf2、HO-1、NQO1、ICAM-1、VCAM-1及Caspase12等蛋白表達的影響(n=8)Fig.3 Effects of EGCG on expression of Nrf2,HO-1,NQO1,ICAM-1,VCAM-1 and Caspase12(n=8)Note:Compared with Control,*.P<0.05；compared with DM,#.P<0.05.

圖4 創(chuàng)口皮膚組織氧化應激指標3-NT的檢測結果(n=8)Fig.4 Detection results of oxidative stress index 3-NT in wound skin(n=8)Note:Compared with Control,*.P<0.05；compared with DM,#.P<0.05.

3 討論

糖尿病及其并發(fā)癥是常見病、多發(fā)病，對人類健康構成極大威脅[11，12]。DNHW是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。高血糖狀態(tài)下引起氧化應激上調，進而引起炎癥因子釋放、細胞凋亡通路激活、細胞再生障礙，最終導致糖尿病傷口愈合障礙。轉錄因子Nrf2是機體抗氧化的核心因子，可進入細胞核內啟動抗氧化基因HO-1和NQO1的轉錄，使細胞內抗氧化蛋白增多，降低細胞氧化應激水平。但生理狀態(tài)下Nrf2與胞漿蛋白伴侶分子KEAP1(Keleh-like ECH-associated protein 1)結合形成復合物，Nrf2活性處于相對抑制狀態(tài)。KEAP1-Nfr2信號通路是抵御外源性和內源性氧化應激損傷的重要防御系統(tǒng)。信號通路的失調與許多疾病有關，如癌癥、糖尿病和呼吸系統(tǒng)疾病。多年來，各種各樣的天然產(chǎn)物為發(fā)現(xiàn)潛在的治療藥物提供了充足的資源。其中多酚類物質具有激動Nrf2活性、抑制ROS的產(chǎn)生、降解KEAP1以及調節(jié)Nrf2相關通路的作用[13]。EGCG可通過結合KEAP1使其變構，導致Nrf2從復合體中釋放，發(fā)揮抗氧化作用[14]。

本研究在成功構建小鼠糖尿病模型和糖尿病傷口障礙模型的基礎上，重點研究EGCG對DNHW的治療效果和相關機制。在小鼠皮膚上人工制造15 mm 創(chuàng)口，分組動態(tài)研究創(chuàng)口的愈合過程，傷口愈合率以傷口的愈合面積占原創(chuàng)口面積的百分率計算。研究結果提示，經(jīng)過10 d的觀察和治療，糖尿病組的傷口愈合率明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證明糖尿病小鼠存在影響傷口愈合的因素。應用EGCG藥物制劑對DNHW進行治療的研究結果提示，糖尿病小鼠中，應用EGCG治療組的傷口愈合率明顯高于非EGCG治療組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證明EGCG對DNHW具有一定的治療作用；在正常對照組小鼠中，應用EGCG治療組和非治療組之間，第10天的傷口愈合率無顯著差異(P>0.05)。

EGCG可與KEAP1結合，導致Nrf2釋放，進入細胞核，啟動下游抗氧化基因HO-1、NQO1等的表達。HO-1、NQO1蛋白作為抗氧化劑抑制糖尿病引起的皮膚細胞氧化應激損傷、炎癥因子釋放、細胞凋亡通路激活等過程，起到對抗DNHW的作用。本實驗對Nrf2、抗氧化基因表達蛋白HO-1和NQO1、氧化應激指標3-NT、炎癥因子ICAM-1和VCAM-2以及促凋亡蛋白Caspase12等指標進行了檢測分析。Western blot檢測結果證實，DM組的Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達量均低于Control組(P<0.05)，說明低水平的Nrf2不足以促進較多的HO-1和NQO1 蛋白，抗氧化應激能力較差，傷口愈合較慢；在糖尿病組和正常對照組中均可見到創(chuàng)口應用EGCG治療后，Nrf2、HO-1和NQO1 蛋白表達量均高于其非治療組(P<0.05)，說明EGCG具有促進Nrf2釋放的能力，上調了HO-1和NQO1 蛋白的表達，增加了抗氧化應激能力，傷口愈合較快。免疫組化實驗檢測3-NT結果顯示，糖尿病組3-NT陽性率明顯高于Control組，證明糖尿病機體皮膚傷口處于較高水平的氧化應激狀態(tài)；在糖尿病組中，應用EGCG的治療組3-NT陽性率明顯低于非EGCG治療組，證明EGCG有效地降低了氧化應激；在正常對照組中，無論是否應用EGCG治療，3-NT陽性率都沒有明顯差異，且處于較低水平的氧化應激狀態(tài)。Western blot檢測結果還證實，糖尿病機體皮膚組織中的ICAM-1和VCAM-2以及Caspase12均高于正常對照組，說明糖尿病機體的傷口局部皮膚存在高炎癥反應和細胞的高凋亡狀態(tài)，這是創(chuàng)口愈合率低下的重要原因；當給予EGCG治療后，在糖尿病組，這些指標均有所下降，創(chuàng)口愈合率也相應提高，證明EGCG對DNHW有明顯的治療作用，并有相應的機制作為理論支撐。

綜上所述，本研究證實了Nrf2是糖尿病并發(fā)癥的關鍵保護性因子；上調機體Nrf2表達可有效減輕糖尿病并發(fā)癥；EGCG作為Nrf2激動劑具有對抗糖尿病引起的氧化應激、炎癥和細胞凋亡的作用，對DNHW有明顯的治療作用。