海南花生果腐病菌的分離、鑒定及生物學特性研究

劉小玉 付登強 余鳳玉

摘要：近幾年，花生果腐病是花生上發生較為嚴重的一種病害，為明確海南花生果腐病病原菌的生物學特性，有效開展病害防治工作，降低該病危害，采用病原菌分離、鑒定，并對其生物學特性進行研究。通過對其培養特性、形態特征的觀察及rDNA的轉錄間隔區（internal transcribed spacers，簡稱ITS）序列測定，與GenBank中同源性較高的菌株進行序列對比，最后將菌株JGF2確定為鐮刀菌。生物學特性研究表明，JGF2菌絲在PDA培養基上生長最快，菌絲生長的最適宜溫度為20～35 ℃，最適pH值為8，乳糖為最佳碳源，牛肉浸膏為最佳氮源。

關鍵詞：海南省;花生;果腐病;鑒定;生物學特性;轉錄間隔區

中圖分類號：S435.652?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0104-03

花生是我國重要的油料作物和經濟作物之一，具有很高的營養價值和經濟價值，在國民經濟中占有重要地位，而近年來我國各大花生產區不斷受到植物病害的侵染，嚴重影響花生產量和品質[1-3]。花生果腐病，別稱爛果病，主要表現在花生莢果腐爛，輕者半個莢果為褐色或黑色，里面的籽粒小而硬實，發育不良，嚴重者整個莢果都為深黑色，果皮和籽粒均已腐爛。花生果腐病在我國各大花生產區發生，輕則減產20%，嚴重的減產80%以上，尤其是在重茬地塊，有逐年加重趨勢[4-5]。國內外研究報道，花生果腐病的病原菌種類復雜，不同地域有不同的致病病原菌，目前我國山東[6]、河北[7]等地有花生果腐病病菌分離鑒定的相關報道，但海南花生還未見相關報道。鑒于果腐病對花生產業的潛在威脅，本研究通過組織分離法對海南文昌花生果腐病的病原菌進行分離、鑒定，并對形態學及生物學特性進行研究，旨在明確病原菌種類，探明其發生傳播規律，為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 試驗材料 從海南文昌花生地采集5株地下莢果有黑色不規則病斑、地上部葉片脫落的花生樣品。

1.1.2 培養基 培養基配制方法參考余鳳玉等報道[8]。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 采用常規組織分離法分離病原菌[9]。

1.2.2 致病性測定 按照柯赫氏法則進行致病性測定。

1.2.3 病原菌形態學觀察 將純化后的病原菌接種到PDA培養基平板上，在25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，觀察記錄菌落形態學特征。

1.2.4 DNA提取、PCR擴增及序列測定 將分離菌株在PDA培養基上培養5～7 d后，收集新鮮的濕菌體0.1～0.3 g，用液氮在研缽中磨碎，裝入 1.5 mL 的離心管中，然后用基因組DNA快速提取試劑盒（真菌）提取DNA。利用通用引物ITS1和ITS4對病原菌的rDNA-ITS區進行PCR擴增。并將PCR產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。將該序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行比對分析，采用BioEdit、Mega 5.0等軟件對菌株進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.5 培養基對菌絲生長的影響 將活化的供試菌株用打孔器打成直徑為6 mm的菌餅，接種于直徑為9 cm的6種供試培養基平板中央，25 ℃恒溫培養，每個處理重復5次，2 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.6 pH值對菌絲生長的影響 用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液將PDA培養基pH值調節到4、5、6、7、8、9、10、11共8個酸堿度。其他同“1.2.5”節。

1.2.7 碳源對菌絲生長的影響 以Czapek培養基為基礎培養基，其中蔗糖分別用等質量碳素的甘露醇、D-果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、阿拉伯樹膠粉、甘油等7種碳源替代，設置無碳作為對照，配制成不同的碳源培養基。其他同“1.2.5”節。

1.2.8 氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養基為基礎培養基，其中硝酸鈉分別用等質量氮素的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏、磷酸二氫銨等5種氮源替代。設置無氮作為對照，配置成不同的氮源培養基。其他同“1.2.5”節。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離純化及致病性

從發病花生果殼樣品中，分離到5個分離物，用孢子懸浮液接種到花生莢果上，5株均產生與田間相似癥狀，其中JGF2致病性最強。從接種發病的花生病健交界處分離純化病菌，經比較與原接種菌株在形態上相同，確認所分離到的分離物為發病植株的病原菌。

菌株JGF2 25 ℃在PDA培養基上菌絲為白色，絨毛狀，顯微鏡觀察到2種不同分生孢子，大型分生孢子鐮刀型，稍彎曲，3～5個隔膜;小型分生孢子長橢圓形至卵圓形，無隔或1個分隔。依據Leslie等的方法[10]鑒定該病原菌均為鐮刀菌。

2.2 病原菌基因序列分析

經rDNA ITS1和ITS4引物對菌株JGF2進行PCR擴增，獲得1條長度為595 bp的片段。將該序列與GenBank中核酸數據庫（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行同源性比較，基于ITS序列構建系統發育樹。如圖1所示，菌株JGF2與鐮刀菌同源性高達100%，進化分析聚在同一分支上，因此可以確定菌株JGF2為鐮刀菌。

2.3 培養基對菌絲生長的影響

菌株JGF2在6種不同的培養基上均能生長，但在PDA培養基上菌絲生長最快，菌落直徑最大，2 d后均長滿平板，且菌落致密濃厚;其次為Richard培養基，菌落直徑為（8.0±0.8） cm;在瓊脂培養基上生長較差，菌落直徑最小，僅有（4.5±0.3） cm，菌絲也最稀疏。由圖2可知，菌株JGF2在不同培養基上菌絲生長差異明顯，PDA培養基最有利于菌絲的生長。

2.4 pH值對菌絲生長的影響

由表1可知，菌株JGF2在pH值為4～11條件下菌絲均能生長，其中pH值為8時，菌絲生長最快，長滿平板，而且菌絲生長茂盛、緊密;而在pH值為9～11條件下，菌絲生長差異不顯著。

2.5 碳源對菌絲生長的影響

2.6 氮源對菌絲生長的影響

由表3可知，不同氮源對菌株JGF2菌絲生長的影響顯著，最適宜的氮源是牛肉浸膏，長滿平板;其次是硝酸鈉，菌落直徑為8.1 cm;硫酸銨作為氮源菌落直徑最小，為2.7 cm，不適合該病原菌的生長;對照的菌落直徑為7.1 cm，但菌絲相當稀薄，在生長范圍內，培養基并未完全被菌絲覆蓋，而其他氮素培養基上，在生長范圍內培養基被菌絲完全覆蓋，菌絲濃密。

3 討論與結論

隨著人民生活水平的提高，嫩花生作為鮮食食品越來越受大家的青睞，發展前景十分廣闊。然而，近年來我國各大花生產區不斷受到植物病害的影響， 特別是花生果腐病發病頻繁。花生果腐病別稱爛果病，在多年重茬種植的地塊結莢期遇雨水較多時發病加重。由于常年高溫多濕的氣候影響，海南花生果腐病已成為花生的一種主要病害，對產量和品質的影響極其嚴重。本研究通過對花生果腐病病菌的鑒定，尤其是對其進行系統的生物學特性研究，為該病害田間防治奠定理論基礎。

根據病原菌的形態學特征分析結果，花生果腐病病原菌鑒定為鐮刀菌。鐮刀菌尤其是茄病鐮刀菌在自然界中普遍存在，是多種植物及動物的致病菌[11-12]，能引起植物根腐、枯萎等癥狀，其產生的毒素不僅影響植物生長，也影響植物品質[13]。本研究結果表明，從海南省文昌市采集到的花生果腐病主要是由鐮刀菌引起的，其鐮刀菌ITS序列長度為 595 bp，是否還有其他病菌與之混合侵染，需進一步采樣分離鑒定。另外，本試驗生物學特性研究表明，菌株JGF2菌絲在PDA培養基上生長最快，菌絲生長的最適宜溫度為20～35 ℃，最適pH值為8，乳糖為最佳碳源，牛肉浸膏為最佳氮源。

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