EGFR基因擴增在食管鱗狀細胞癌中的預后價值

朱 娜，蔣冬先，侯英勇

食管癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細胞癌是食管癌最常見的組織類型。患者在診斷時常已處于晚期，因此預后極差。盡管手術治療、放療、化療不斷在進展，但5年生存率仍不足20%。近些年，分子靶向治療已經成為一種重要的治療方法。表面生長因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)家族包含4個成員，EGFR、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER-3和ErbB4/HER-4，作為酪氨酸激酶受體，在細胞信號傳導、控制細胞增殖和分化中起重要作用。EGFR或HER-2基因擴增和過表達在食管癌中經常發生，食管鱗狀細胞癌主要表現為EGFR基因擴增，而食管腺癌主要表現為HER-2基因擴增。根據EGFR基因在腫瘤細胞生物學中的作用和在食管鱗狀細胞癌中的表達情況，EGFR基因很可能是食管鱗狀細胞癌很重要的治療靶點之一。但根據目前的研究，EGFR基因改變情況需要更大宗的數據分析，其與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征之間的相關性及預后的關系仍不明確。因此，本實驗旨在探討EGFR基因擴增在食管鱗狀細胞癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2007～2010年復旦大學附屬中山醫院胸外科診治的504例食管鱗狀細胞癌患者。所有患者在手術前均未接受放、化療。所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法 標本均經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，制作組織芯片(tissue microarray,TMA)。4 μm厚切片，行HE染色和FISH檢測。臨床病理相關因素包括患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位(食管上段、中段及下段)、腫瘤直徑(以3.3 cm為界限分兩組)、分化程度(高、中、低)、脈管侵犯情況、神經侵犯情況、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況及臨床分期(分Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳa兩組)。雙色EGFR探針中紅色信號探針為EGFR探針，特異性定位在EGFR基因座(7p12)，綠色信號探針為7號染色體著絲粒探針(7p11.1-q11.1)。具體操作步驟類似于之前報道的HER-2-FISH過程[1]。

連續計數至少100個腫瘤細胞EGFR信號，可分為6種類型：(1)二倍體：>90%腫瘤細胞拷貝數≤2；(2)低三倍體：10%～40%腫瘤細胞拷貝數≤3；(3)高三倍體：≥40%腫瘤細胞拷貝數≤3；(4)低多倍體：10%～40%腫瘤細胞拷貝數≥4；(5)高多倍體：>40%腫瘤細胞拷貝數≥4；(6)基因擴增：EGFR基因簇狀擴增，或EGFR/CEP7≥2，或≥10%腫瘤細胞拷貝數≥15。EGFR基因FISH陽性被定義為EGFR高多倍體或基因擴增[2-3]。

1.3 隨訪 504例患者均獲得完整隨訪資料。隨訪資料來自于病歷記錄、電話隨訪以及家訪。隨訪時間截至2015年11月。無瘤生存期(disease-free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)指從手術切除時間到第一次腫瘤復發時間(或最近隨訪時間)和死亡時間。

1.4 統計學分析 χ2檢驗用于單因素分析，不同評分系統的一致性通過Kappa進行測量，統計學差異通過McNemar檢驗進行分析。使用Kaplan-Meier分析計算DFS和OS。Log-rank檢驗用于比較生存分析中作為變量函數的DFS和OS，并用于識別差異的顯著性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征與分組 504例食管鱗狀細胞癌中，男女比約5 ∶1。以中下段食管鱗狀細胞癌為主。以中～低分化為主(96.2%)。腫瘤直徑以3.3 cm為界值，直徑<3.3 cm病例稍多于直徑≥3.3 cm的病例數。脈管、神經侵犯的病例數明顯少于未侵犯的病例數。根據腫瘤的浸潤深度，以T2、T3為主，即癌組織多侵及肌層及外膜層。54.0%的病例未見淋巴結轉移。

按照AJCC第8版食管癌分期數值，將腫瘤分期分為Ⅰ+Ⅱ(55.6%)及Ⅲ+Ⅳa(44.4%)兩組。根據生存時間分段，將患者分為小于24個月及大于24個月兩組。

2.2 食管鱗狀細胞癌中EGFR基因擴增與臨床病理特征的關系 EGFR-FISH陽性共61例(12.1%)，EGFR-FISH擴增共32例(6.3%)(圖1，表1)。

AB

圖1 A.EGFR高多倍體：腫瘤細胞內紅綠色信號比增加(70%腫瘤細胞拷貝數約≥4)；B.EGFR基因擴增：腫瘤細胞內見簇狀擴增紅色信號(紅色信號代表EGFR基因，綠色信號代表CEP7)

2.3 食管鱗狀細胞癌中EGFR基因擴增與預后的關系 504例食管鱗狀細胞癌患者EGFR-FISH不同檢測結果分別在全部患者、Ⅰ+Ⅱ期患者、Ⅲ+Ⅳa期患者、生存期小于24個月患者及生存期大于24個月患者等5種不同人群的DFS及OS中進行預后分析。其中EGFR-FISH陽性與擴增結果對比，在全部患者、Ⅲ+Ⅳa期患者及生存期小于24個月的患者中未顯示明顯差異，而在Ⅰ+Ⅱ期患者及生存期大于24個月的患者中差異有顯著性(表2)。EGFR-FISH擴增在全部患者、Ⅰ+Ⅱ期患者及生存期大于24個月的患者中DFS及OS差異有顯著性(圖2)。

表1 504例食管鱗狀細胞癌中EGFR-FISH結果與臨床病理特征的相關性

表2 504例食管鱗狀細胞癌患者EGFR-FISH檢測結果在不同人群中的預后意義

圖2 EGFR基因擴增組與非擴增組在總人群(A、B)、Ⅰ+Ⅱ期患者(C、D)及生存時間大于24個月的患者(E、F)中的總生存期和無瘤生存期的生存曲線；0代表EGFR-FISH非擴增組；1代表EGFR-FISH擴增組

3 討論

中國屬于食管癌高危區，鱗狀細胞癌是主要的組織學類型。男女間的發生率具有很大的地區差異，在中國主要以男性為主。吸煙是食管鱗狀細胞癌發生的一個主要危險因素。食管癌主要位于食管中1/3段，隨后依次為下1/3段和上1/3段，有數據顯示位于上段和中段的鱗狀細胞癌比下段的鱗狀細胞癌更具有侵襲性。TNM分期、腫瘤的分化程度及位于食管的位置都作為預后分組因素。此研究數據顯示的食管鱗狀細胞癌的臨床特征與其流行病學調查結果一致，且樣本量大，因此通過本組實驗分析能充分、準確展示EGFR基因在食管鱗狀細胞癌中的作用。

EGFR基因改變在癌中主要分為兩類：一類是EGFR基因第18～21號外顯子的位點突變，主要發生在亞洲肺腺癌[4]；另一類是EGFR基因擴增和蛋白的過表達[5]。EGFR基因在食管鱗狀細胞癌中主要是基因拷貝數的改變[6-8]，罕見基因位點突變[1,9]。關于EGFR基因擴增與過表達之間的關系在近期很多文獻中進行了討論，兩者存在相關性(P<0.01)，其中存在基因擴增者均有EGFR蛋白過表達[5]。文獻報道顯示，具有EGFR擴增和過表達的食管鱗狀細胞癌受益于西妥昔單抗治療[10]。本組實驗主要應用FISH技術探索EGFR基因拷貝數的改變在食管鱗狀細胞癌中的價值。首先，本組實驗用FISH檢測EGFR基因變化情況與之前文獻報道過的數據一致，包括二倍體、低三倍體、高三倍體、低多倍體、高多倍體及基因擴增[7]。其中EGFR-FISH高多倍體及基因擴增具有較高的比例(12.1%)。文獻報道中食管鱗狀細胞癌的樣本量相對不足(多不足100例)，而本組實驗共獲取504例食管鱗狀細胞癌標本，相比更能反映EGFR基因改變在食管鱗狀細胞癌中的真實情況。其次，文獻中指出EGFR基因擴增狀態與患者腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況呈正相關，提示EGFR基因拷貝數的增加與腫瘤的浸潤、轉移等行為密切相關[11]。本組實驗利用FISH技術探索EGFR基因拷貝數改變，其中EGFR-FISH陽性包括高多倍體和基因擴增，在探索EGFR基因改變在食管鱗狀細胞癌中的價值時，著重分析EGFR-FISH陽性與EGFR-FISH擴增兩組。

在EGFR-FISH與臨床病理因素的相關性分析中，EGFR-FISH陽性與腫瘤的浸潤深度具有一定的相關性，根據TNM分期，EGFR-FISH陽性更常發生于T2、T3中，不出現在T4中，但顯著無統計學意義。其他臨床病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、脈管神經侵犯、淋巴結轉移情況及臨床分期均無明顯相關性。

與EGFR-FISH陽性組不同，EGFR基因擴增與腫瘤浸潤深度并無相關性，但在年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、脈管神經侵犯、淋巴結轉移等臨床病理特征中，兩組相似，均與上述臨床病理特征無相關性。然而，EGFR基因擴增與臨床分期密切相關，EGFR基因擴增更容易發生于III+IVa期的食管鱗狀細胞癌患者。無論DFS或OS，EGFR基因擴增在全部患者及Ⅰ+Ⅱ期患者中均具有更差的預后，尤其是在生存期超過24個月的患者中差異有統計學意義(P<0.05)。

因此，在食管鱗狀細胞癌中具有一定比例的EGFR-FISH擴增。EGFR-FISH擴增與臨床病理特征密切相關，是食管癌中有價值的預后因子，而且相對EGFR-FISH陽性而言，EGFR-FISH擴增似乎更適合作為臨床實踐中的參考值。EGFR基因擴增聯合其他基因的改變在食管癌中的價值也值得進一步探討。