喉鱗狀細胞癌中ZNF750的表達及與預后的關系

郭林芝，王 麗，曹紅艷，劉青華，閆玲艷，菅曉婷，吳月琴，李靈敏

喉鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一[1]，治療主要包括手術、放療和化療，由于腫瘤具有較強的侵襲性和轉移能力，患者術后生存率低，預后較差[2]。尋找與喉鱗狀細胞癌侵襲、轉移相關的生物學指標，不僅有助于判斷預后，而且可以為喉鱗狀細胞癌生物學治療靶點的選擇提供依據。ZNF750是ZNF家族中的一員，含有典型的C2H2鋅指結構域。ZNF750基因編碼的蛋白，通常在復層扁平上皮細胞中表達，是上皮細胞分化的重要調控因子，對增殖相關基因及分化相關基因分別起抑制及促進作用[3]。有研究顯示其與食管癌等多種腫瘤的發病及預后密切相關，Lawrence等[4]對腫瘤組學測序數據進行生物信息學分析，發現在頭頸鱗狀細胞癌中ZNF750的突變顯著；Zhang等[5-6]證實食管鱗狀細胞癌和口腔鱗狀細胞癌中ZNF750是一種腫瘤抑制基因；低表達ZNF750的食管鱗狀細胞癌患者預后較差[7]；高表達ZNF750的食管鱗狀細胞癌患者對放、化療的敏感性高[8]。目前，ZNF750在喉鱗狀細胞癌發病機制中的生物學功能尚不清楚，本實驗檢測ZNF750在喉鱗狀細胞癌中的表達，探討其與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系及意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2012年1月山西省腫瘤醫院手術切除的115例喉鱗狀細胞癌標本和56例癌旁正常喉組織標本；另收集6對新鮮喉鱗狀細胞癌組織及配對癌旁正常喉組織。所有患者均有完整的臨床資料，術前均未接受放、化療，且術后病理切片均由病理科兩位以上病理醫師確診為喉鱗狀細胞癌。電話隨訪患者每3個月1次，隨訪日期從手術日期開始到患者死亡或術后5年止。

1.2 主要試劑 兔多克隆抗ZNF750抗體購自Proteintech公司，即用型快捷免疫組化EnVision試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測ZNF750的表達 115例喉鱗狀細胞癌標本和56例癌旁正常喉組織標本，均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)高壓修復2 min，晾至室溫，10%BSA室溫封閉20 min，滴加ZNF750抗體(1 ∶200)，4 ℃冰箱過夜。滴加二抗37 ℃ 40 min，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封固；鏡下觀察、拍照。

1.3.2 Western blot法檢測ZNF750的表達 將6對新鮮喉鱗狀細胞癌組織和癌旁正常喉組織研碎加入細胞溶解液提取蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測提取的組織溶液蛋白濃度，將等量的總蛋白進行電泳分離，轉移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后放入抗ZNF750抗體(1 ∶500)溶液中，4 ℃搖床過夜。洗膜后放入二抗中孵育，再洗膜，顯影。顯影后的膠片用Image J軟件掃描分析。

1.4 結果判讀 ZNF750蛋白陽性信號定位于細胞核，根據細胞染色強度計分：無著色為0分、弱著色為1分、中等著色為2分、強著色為3分；根據陽性細胞所占百分比計分：0～29%為1分、30%～59%為2分、>60%為3分。兩者得分相加：≥3分為高表達，<3分為低表達。每張切片分別取5個不同視野進行觀察后取平均值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析。采用t檢驗、χ2檢驗、Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風險回歸模型對ZNF750蛋白表達、臨床病理特征、總生存期、預后因子的單-多因素分析進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉鱗狀細胞癌中ZNF750的表達 采用Western blot法檢測6對新鮮喉鱗狀細胞癌組織及癌旁正常喉組織中的ZNF750蛋白，結果顯示ZNF750在喉鱗狀細胞癌組織中的蛋白水平明顯低于癌旁正常喉組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)；免疫組化法檢測115例喉鱗狀細胞癌組織及56例癌旁正常喉組織石蠟切片，結果顯示：ZNF750在喉鱗狀細胞癌組織中的表達明顯低于癌旁正常喉組織，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 Western blot法檢測喉鱗狀細胞癌組織和癌旁正常喉組織中ZNF750的表達

2.2 喉鱗狀細胞癌中ZNF750表達與臨床病理特征的相關性 ZNF750低表達與喉鱗狀細胞癌臨床TNM分期、淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)；ZNF750低表達與患者性別、年齡、吸煙、飲酒及分化程度差異無統計學意義(表1)。

2.3 喉鱗狀細胞癌中ZNF750表達與預后的關系 Kaplan-Meier生存曲線結果表明，ZNF750低表達患者的總生存率低于高表達患者(P<0.05，圖3)，高表達患者5年生存率為78.0%，低表達患者5年生存率為47.3%。單因素分析表明，腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、ZNF750低表達是影響患者預后的重要因素(P<0.05)。多因素分析表明，ZNF750低表達是喉鱗狀細胞癌患者獨立的預后因子(P<0.05，表2)。

AB

圖2 ZNF750在喉鱗狀細胞癌組織(A)和癌旁正常喉組織中(B)的表達，EnVision兩步法

表1 ZNF750表達與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關性

圖3 喉鱗狀細胞癌ZNF750低表達和高表達患者的生存曲線

表2 喉鱗狀細胞癌臨床特征與總生存期的單因素與多因素分析

3 討論

ZNF750基因定位于17q25.3，是編碼723個氨基酸的蛋白質，主要表達于復層扁平上皮組織，是角質形成細胞分化的重要調節因子，調節角質形成細胞的終末分化。

文獻報道，與正常組織相比ZNF750的表達水平在鱗狀細胞癌患者中明顯降低[9]，ZNF750突變與上皮來源的惡性腫瘤發生、發展有關。ZNF750在鱗狀細胞癌中常發生突變，突變點主要位于C2H2鋅指結構域，提示鋅指結構域在介導ZNF750的抑癌活性中起重要作用[3]。ZNF750通過C2H2鋅指結構域與靶基因作用，抑制增殖相關基因(RBBP8、HOMER3)的表達，激活分化基因(PPL、PKP1)的表達[10]。本實驗通過Western blot法和免疫組化法對喉鱗狀細胞癌和癌旁正常喉組織中ZNF750蛋白表達進行檢測，結果顯示：ZNF750在喉鱗狀細胞癌組織中的蛋白水平明顯低于癌旁正常喉組織，提示ZNF750蛋白表達減少與喉鱗狀細胞癌的發生有關。目前，ZNF750缺失導致腫瘤發生的機制尚不明確。有研究顯示，ZNF750作為一種轉錄因子，與靶基因RCOR1和CTBP1/2相互作用，抑制增殖相關基因的表達；與靶基因RCOR1、KLF4和CTBP1/2相互作用，激活分化基因的表達[10]。因此，當ZNF750突變后，無法抑制細胞過度增殖，同時細胞分化受損可能是導致腫瘤發生的原因之一。

本實驗對ZNF750表達與喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的相關性進行分析，結果顯示，ZNF750低表達與臨床TNM分期、淋巴結轉移顯著相關。生存分析結果顯示，ZNF750低表達是喉鱗狀細胞癌患者預后不良的獨立的危險因素，ZNF750低表達患者的總生存率低于高表達患者。以上結果提示，ZNF750低表達與腫瘤的發展及轉移密切相關，與Otsuka等[7]的研究結果一致，可能是ZNF750調節一組參與細胞遷移、增殖和黏附的基因，特別是ZNF750直接誘導長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達，lncRNA影響細胞的增殖、周期、凋亡等，與腫瘤的發生、發展密切相關[11]；并抑制LAMC2的表達，從而調節癌細胞的增殖和遷移[12]。

總之，本實驗結果顯示喉鱗狀細胞癌組織中ZNF750表達明顯減少，ZNF750低表達與喉鱗狀細胞癌TNM分期、淋巴結轉移及預后有關；提示ZNF750可能是一種新的預后生物標志物，對其調控可能成為喉鱗狀細胞癌生物治療的重要靶點之一。