CHK1和RAD51蛋白表達與胰腺導管腺癌浸潤和轉移的關系

閆靜波，李 輝，衛 茹，齊 蕾，王 博

胰腺癌的發生是多因素共同作用的復雜過程。90%以上的胰腺癌為導管腺癌，其來源于胰腺導管上皮細胞，是惡性度較高預后最差的惡性腫瘤之一。近年來胰腺癌的發病率呈上升趨勢[1]。因此，現階段胰腺導管腺癌的早期篩查診斷和新的標志物發現具有重要意義。細胞周期檢驗點激酶1(checkpoint kinase 1, CHK1)在腫瘤的發生發展、腫瘤耐藥性等方面發揮重要作用，在許多腫瘤細胞中表達升高，是一種細胞檢驗點的轉導因子[2]。DNA雙鏈斷裂修復蛋白(RAD51)能夠促進腫瘤的生長及轉移，是一種DNA雙鏈斷裂修復蛋白[3]。本文采用Western blot法及免疫組化EnVision法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達，分析兩者在胰腺導管腺癌浸潤和轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2006～2017年河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院病理科存檔的103例胰腺導管腺癌標本。患者術前均未行放、化療。103例中男性68例，女性35例；年齡<60歲者45例，≥60歲者58例；腫瘤最大直徑<2 cm 35例，≥2 cm 68例；組織學分級：高分化41例，中+低分化62例；無淋巴結轉移者50例，淋巴結轉移者53例；腫瘤分期：Ⅰ+Ⅱ期63例，Ⅲ+Ⅳ期40例。另收集癌旁正常胰腺標本(取自胰腺癌標本距離腫瘤邊緣3 cm以外的正常胰腺組織)103例。

胰腺導管腺癌標本和癌旁正常胰腺標本，均分兩種方法保存：一種液氮凍存，行Western blot法檢測；另一種經10%中性福爾馬林固定保存，行常規HE及免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用免疫組化EnVision法檢測CHK1及RAD51蛋白表達，具體實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。(1)根據陽性細胞數與總細胞數比值計分：陽性細胞數<10%為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。(2)根據細胞著色強度來計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：≥2分為陽性，0～1分為陰性。

1.2.2 Western blot法 對癌旁正常胰腺標本和胰腺導管腺癌標本的蛋白進行提取，然后繪制蛋白標準曲線，參照蛋白標準曲線測定蛋白含量，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉膜，硝酸纖維素膜經TBS振蕩漂洗2次，5%BSA常溫振蕩封閉。TBST振蕩漂洗3次，在膜上滴加封閉液稀釋的抗鼠單克隆一抗(CHK1及RAD51)，4 ℃過夜。次日回收一抗，TBST振蕩漂洗硝酸纖維素膜3次。在膜上滴加二抗，室溫1 h，TBST振蕩漂洗3次，TBS振蕩漂洗。加入堿性磷酸酶顯色劑顯色，見有清晰條帶出現即用雙蒸水終止顯色。將硝酸纖維素膜用掃描儀對蛋白表達條帶進行灰度掃描，經自動圖像分析系統進行半定量分析，癌旁正常胰腺標本組的平均光密度值(OD值)取值為1，胰腺導管腺癌標本與正常胰腺標本相比取值。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌和癌旁正常胰腺組織中的表達及與胰腺導管腺癌臨床病理特征的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化法檢測CHK1及RAD51蛋白表達 免疫組化結果顯示：CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

①A①B①C②A②B②C

圖1 CHK1在癌旁正常胰腺(A)、高分化胰腺導管腺癌(B)和低分化胰腺導管腺癌(C)中的表達，EnVision法 圖2 RAD51在癌旁正常胰腺(A)、高分化胰腺導管腺癌(B)和低分化胰腺導管腺癌中(C)的表達，EnVision法

表1 免疫組化法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達[n(%)]

2.2 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白表達 Western blot法結果顯示：CHK1及RAD51在胰腺導管腺癌組織中的表達高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05，表2，圖3)。

表2 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達

圖3 Western blot法檢測CHK1及RAD51蛋白在胰腺導管腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達：1.癌旁正常胰腺；2.胰腺導管腺癌

2.3 CHK1及RAD51蛋白表達與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系 統計結果顯示：CHK1及RAD51蛋白表達與胰腺導管腺癌病理分化程度、淋巴結轉移及腫瘤分期相關(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白在中+低分化胰腺導管腺癌組中的表達高于高分化組；CHK1及RAD51蛋白在有淋巴結轉移胰腺導管腺癌組中的表達高于無淋巴結轉移組；CHK1及RAD51蛋白在Ⅲ+Ⅳ期胰腺導管腺癌組中的表達高于Ⅰ+Ⅱ期組(表3)。

2.4 CHK1和RAD51蛋白在胰腺導管腺癌中表達的相關性 經Spearman相關分析，胰腺導管腺癌組織中CHK1和RAD51蛋白表達呈正相關(r=0.514 3，P<0.05)。

3 討論

胰腺導管腺癌是胰腺癌最常見的病理類型，發生于胰腺導管上皮細胞。胰腺癌發病隱匿，診治困難，是惡性度較高預后最差的惡性腫瘤之一[4]。胰腺癌的病因復雜，膽道系統疾病或基因突變可能是胰腺癌發生的基礎因素。有研究結果顯示，分子生物或基因調控的變化是胰腺癌發生、發展的另一重要因素[5]。分子蛋白的改變，導致癌細胞的生物學改變，影響癌細胞的周期調控及基因修復，增強其基因不穩定性，從而增加腫瘤易感性，促進腫瘤的生成和轉移[6]。本組實驗分析RAD51和CHK1蛋白表達與胰腺導管腺癌的發生、發展的關系，能夠為胰腺癌的早期篩查及預后評估提供新的標志物，探討胰腺癌的發病機制，為胰腺癌的治療尋找新的方法和途徑。

CHK1是一種細胞檢驗點轉導因子，可以對各種因素導致的DNA損傷進行修復，其異常表達會造成周期檢測點不能修復機體DNA的損傷，引起腫瘤的發生、發展[7]。研究表明，CHK1與腫瘤的多藥耐藥性、腫瘤的侵襲轉移密切相關，在腫瘤中表達升高[8-9]。RAD51蛋白是一種參與同源重組修復的DNA雙鏈斷裂修復蛋白[10]。然而，RAD51蛋白升高會增加姐妹染色體的交換及同源重組，從而增加遺傳的差異和基因的不穩定，加速瘤細胞增殖，造成瘤細胞分化成熟障礙及腫瘤的發生、發展[3]。RAD51蛋白的一些氨基酸突變也會滅活該基因，引起腫瘤的發生[11]。

表3 CHK1及RAD51表達與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系

CHK1和RAD51蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白表達與胰腺導管腺癌病理分化程度、淋巴結轉移及腫瘤分期相關(P<0.05)。CHK1及RAD51蛋白在中+低分化胰腺導管腺癌組中的表達高于高分化組；CHK1及RAD51蛋白在淋巴結轉移胰腺導管腺癌組中的表達高于無淋巴結轉移組；CHK1及RAD51蛋白在Ⅲ+Ⅳ期胰腺導管腺癌組中的表達高于Ⅰ+Ⅱ期組。隨著胰腺導管腺癌的進展，CHK1和RAD51蛋白表達升高，且CHK1和RAD51蛋白表達呈正相關，提示CHK1和RAD51蛋白可能共同促進胰腺導管腺癌的發生、發展。隨著腫瘤的進展，惡性程度的增高，CHK1和RAD51蛋白表達升高。在有淋巴結轉移和臨床分期高的胰腺導管腺癌中，CHK1和RAD51蛋白表達均增強，提示CHK1和RAD51蛋白可能促進胰腺導管腺癌的淋巴結轉移，促使胰腺導管腺癌的生長加速，提高胰腺導管腺癌的臨床分期，臨床分期高和有淋巴結轉移的胰腺導管腺癌患者預后較差。由此推測，CHK1和RAD51蛋白可能與胰腺導管腺癌的發生、發展有一定的關系，CHK1和RAD51蛋白可能是胰腺導管腺癌分級分期的重要標志，兩者能夠作為胰腺導管腺癌患者預后評價的參考指標，這與作者先前研究的CHK1和RAD51在食管、胃結合部癌的研究結果相同[12-13]。

有研究結果表明，CHK1和RAD51蛋白在腫瘤細胞內表達升高，瘤細胞基因組不穩定性增加，因此CHK1和RAD51蛋白升高的腫瘤患者，腫瘤細胞對化療及放療不敏感[11,14]。以CHK1和RAD51為靶點，基因治療技術和蛋白質組學相結合，能夠使瘤細胞對放、化療的敏感性增強，是治療腫瘤的新途徑[11,14]。因此，CHK1和RAD51蛋白有可能成為治療胰腺導管腺癌的新靶點。

CHK1及RAD51蛋白表達與胰腺導管腺癌病理分化程度、淋巴結轉移及腫瘤分期相關。隨著胰腺導管腺癌的進展，CHK1和RAD51蛋白表達升高。研究結果說明：CHK1和RAD51蛋白可能與胰腺導管腺癌的發生、發展有一定的關系。CHK1和RAD51蛋白對胰腺癌的發生、發展及預后有重要的臨床意義，其可能成為臨床上胰腺導管腺癌的早期篩查及預后的新標志物。如果深入探究CHK1和RAD51蛋白在胰腺導管腺癌中的表達，CHK1和RAD51蛋白有可能成為治療胰腺導管腺癌的新靶點，給胰腺導管腺癌的治療帶來新途徑。