肝癌組織中PKM2表達及與放療敏感性的關系

馬 歡，蘆東徽，徐 濱，徐明靜，胡 勇，潘躍銀

肝癌是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一。據統計，2018年全球有62.6萬以上的新發肝癌病例，發病率位居惡性腫瘤的第5位，病死率位居第3位[1]。近年來，我國肝癌的發病率呈逐年增長趨勢，目前每年約有35萬新發肝癌病例，且病死率高[2]。三維適形放療是肝癌患者臨床常用的治療措施，其療效與患者對放療的敏感性緊密相連。M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase, PKM2)主要位于細胞質，在腫瘤細胞中該蛋白的表達水平較高，可參與基因轉錄調控和細胞內信號轉導[3]。有研究證實[4]，肝癌組織中PKM2蛋白表達與患者預后密切相關，但該蛋白表達與放療敏感性關系的文獻鮮有報道。鑒于此，本實驗收集80例肝癌患者的臨床資料，旨在探討肝癌組織中PKM2表達與放療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年2月～2018年10月中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院腫瘤科診治的80例肝癌患者。病例納入標準：(1)均行肝臟穿刺活檢術且均病理檢查證實為肝癌；(2)均實施三維適形放療；(3)均未接受其它種類抗腫瘤治療；(4)均有完整的臨床資料；排除標準：(1)復發性或轉移性肝臟惡性腫瘤者；(2)伴有重要臟器功能障礙者；(3)合并精神障礙者；(4)合并認知障礙或溝通障礙者；(5)存在嚴重外傷者。80例中男性45例，女性35例，年齡41～76歲，平均(56.96±6.82)歲，臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期22例、Ⅲ期36例、Ⅳ期16例。分化程度參照Edmondson-Steiner分級標準，低分化(近似來源組織的不成熟形態)21例、中分化(分化程度低，但明確保留起源組織的特點)30例、高分化(分化程度高，接近來源組織的成熟形態)29例。本次實驗經中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測肝癌組織中PKM2蛋白表達 染色步驟：常規脫蠟、水合、切片、固定、水化，抗原熱修復，滴加一抗，劑量為50～100 μL，4 ℃孵育過夜，以PBS緩沖液沖洗后滴加通用型鼠/兔聚合物，劑量為50 μL，37 ℃濕盒孵育20 min，顯色。以蘇木精復染，加入鹽酸分化，自來水沖洗返藍。脫水后封固，在鏡下觀察組織中蛋白表達，以細胞質出現棕色或棕黃色染色為蛋白陽性，將蛋白陽性率>10%者記為陽性。

1.2.2 三維適形放療法 采用CT掃描，層厚和層距均設置3.0 mm。將掃描結果傳輸至三維適形治療計劃系統，勾畫靶區，觀察圖像并確認腫瘤體積后輸入數據，計劃靶體積為腫瘤體積外放1.0～1.5 cm。使用直線加速器15MV-X射線照射，每次劑量為2 Gy，每天1次，每周5次，總照射劑量為60 Gy。

1.3 觀察指標 (1)統計本組患者肝癌組織中PKM2蛋白的表達。(2)對比不同PKM2蛋白表達患者放療前后血清AFP水平差異，采用酶聯免疫吸附試驗檢測。(3)對比不同PKM2蛋白表達患者放療效果，參照實體瘤療效判定標準，完全緩解、部分緩解者均記為放療敏感；穩定、進展者均記為放療不敏感，且完全緩解與部分緩解例數總和構成比為緩解率。(4)分析PKM2蛋白表達與放療敏感性的關系。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料比較采用t檢驗；計數資料以百分數描述，等級分布比較以秩和檢驗；采用Logistic回歸分析探討PKM2蛋白表達與放療敏感性的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織中PKM2蛋白的表達 80例肝癌組織中PKM2蛋白陰性10例，陽性70例，陽性率為87.50%(70/80)(圖1～4)。

①②③④

圖1 肝癌(Ⅲ期)組織中PKM2蛋白陰性，EliVision法 圖2 肝癌(Ⅳ期)組織中PKM2蛋白弱陽性，EliVision法 圖3 肝癌(Ⅱ期)組織中PKM2蛋白中等陽性，EliVision法 圖4 肝癌(Ⅳ期)組織中PKM2蛋白強陽性，EliVision法

2.2 不同PKM2蛋白表達患者放療前后血清AFP水平 放療前后肝癌組織PKM2蛋白陽性者血清AFP水平均高于陰性者(P<0.05)，且放療后血清AFP水平均低于放療前(P<0.05，表1)。

表1 不同PKM2蛋白表達患者放療前后血清AFP水平

2.3 不同PKM2蛋白表達患者放療效果 PKM2蛋白陽性者放療效果等級分布與陰性者對比差異有統計學意義(Z=6.783，P=0.009)，且PKM2蛋白陽性者緩解率(放療敏感率)明顯低于陰性者(χ2=6.445，P=0.011，表2)。

2.4 PKM2蛋白表達與放療敏感性的關系 放療不敏感患者臨床分期、分化程度、PKM2蛋白表達與放療敏感者對比差異均有統計學意義(P<0.05，表3)，且均是放療不敏感的獨立危險因素(P<0.05，表4)。

表3 放療敏感患者與不敏感患者可能因素的構成比[n(%)]

表4 Logistic回歸分析

3 討論

研究表明[5]，除病理特征可能會影響肝癌患者放療敏感性外，細胞增殖與凋亡調控相關基因也是此類患者放療敏感性的重要影響因素。另有研究表明[6]，肝癌組織中PKM2蛋白表達水平明顯高于癌旁正常組織，且其表達水平也可影響惡性腫瘤細胞的增殖及腫瘤生長。

表2 不同PKM2蛋白表達患者放療效果[n(%)]

本實驗結果顯示，肝癌組織中PKM2蛋白陽性率為87.50%，呈高表達，與Yang等[7]的報道相符。另外，PKM2蛋白陽性者放療前血清AFP水平高于陰性者，放療后均下降，且放療后前者仍高于后者，可知PKM2蛋白陽性者血清AFP水平高，雖經化療可控制血清AFP水平，但化療后相較于PKM2蛋白陰性者，陽性者血清AFP水平仍較高。血清AFP是原發性肝癌常見的腫瘤標志物之一，與臨床分期密切相關，且其水平越高，患者預后越差。PKM2蛋白是腫瘤組織有氧酵解過程中的關鍵酶，其表達水平越高，糖酵解代謝為腫瘤細胞生長和增殖提供的能量越多，腫瘤細胞快速分裂和增殖的物質基礎也越多[8]。在肝癌患者中應當積極控制PKM2蛋白的表達水平，控制腫瘤細胞生長和增殖所需的能量、原料供應。

此外，本實驗亦發現，肝癌組織中PKM2蛋白陽性者緩解率(放療敏感率)明顯低于陰性者，可知肝癌組織中PKM2蛋白陽性者放療不敏感的可能性大，放療效果不甚理想。探討PKM2蛋白表達與放療敏感性的關系，結果顯示臨床分期Ⅲ期、臨床分期Ⅳ期、低分化、PKM2蛋白陽性均是放療不敏感的獨立危險因素(OR=3.274、5.328、5.942、7.135，P<0.05)，可知上述因素均可影響放療敏感性，導致療效不理想。既往有報道證實[9]，臨床分期Ⅲ期、臨床分期Ⅳ期、低分化均可影響放療敏感性，與本實驗結果一致，原因可能為：臨床分期越高，患者病情越嚴重，且體質越差，可能影響放療敏感性；分化越低，肝癌的惡性程度越高，疾病進展越快，因而放療敏感性越差。此外，推測PKM2蛋白表達越高，為惡性腫瘤細胞生長和增殖所需的能量、原料供應量越充足，因而放射線殺滅惡性腫瘤細胞的難度越大，放療不敏感的風險也越高。因此，在臨床實踐中應積極控制PKM2蛋白的表達，尤其是對于低分化的肝癌患者應加強重視，合理采用輔助治療措施方可達到理想效果。

綜上所述，在肝癌組織中PKM2蛋白表達水平高，與血清AFP水平、放療效果緊密相聯，且PKM2蛋白陽性等均是影響放療敏感性的危險因素，針對上述因素均應積極防控，以提升放療效果，改善患者預后。