非小細胞肺癌中TNC、USP22和Ki-67的表達及臨床意義

馬禮鴻，高 靜，王 凱，李婷燕，劉曉麗

非小細胞肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其浸潤、轉移是導致非小細胞肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤本質上是一種基因病，腫瘤的浸潤、轉移是多步驟、多因素參與的復雜多變的生物學過程。細胞外基質與腫瘤生長、轉移密切相關，TNC作為細胞外基質的重要組成部分是一種大分子量細胞外基質糖蛋白，有研究表明，TNC可表達于人類多種惡性腫瘤中，且對腫瘤細胞的浸潤、轉移具有一定的抑制效應[1]。腫瘤標志基因USP22主要是通過對底物靶分子去泛素化修飾發揮重要功能，在腫瘤進展過程中可能起關鍵作用[2]。Ki-67是單克隆抗體Ki-67的抗原標志物，同時也是現階段最被認可的腫瘤細胞增殖標志物，其蛋白表達水平和腫瘤惡性程度有關，可作為腫瘤侵襲、轉移及預后判斷的依據[3]。本組前期實驗提示[4]，XIAP表達增高可能與腫瘤高度浸潤和轉移有關，XIAP高表達可能使非小細胞肺癌細胞逃避凋亡機制和生長監控異常增殖，促進非小細胞肺癌的發生、發展。本實驗將在前期實驗的基礎上，采用RT-PCR和免疫組化法聯合檢測非小細胞肺癌組織中TNC、USP22、Ki-67基因的表達水平，初步探討非小細胞肺癌的發生和浸潤轉移機制，為其臨床治療及預后判斷提供重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2017年5月～2018年10月遵義醫學院及遵義市第一人民醫院病理科存檔的手術切除的新鮮非小細胞肺癌組織46例，每份標本留取癌組織和癌旁正常組織，離體后一部分組織快速加入總RNA提取試劑TRIZOL進行后續RT-PCR檢測，另一部分組織加入10%中性福爾馬林固定進行后續免疫組化試驗。其中腺癌26例，鱗狀細胞癌20例。男性24例，女性22例；年齡<45歲21例，≥45歲25例；腫瘤直徑≤2 cm者18例，>2 cm 28例。按WHO標準，組織學分級：高分化19例，中分化10例，低分化17例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期23例；有淋巴結轉移者21例，無淋巴結轉移者25例。

1.2 主要試劑 一抗兔抗人TNC、USP22、Ki-67均購自Abcam公司；SP免疫組化染色試劑購于北京中杉金橋公司；細胞總RNA提取試劑TRIZOL、c-DNA合成試劑盒和2×taq PCR Master Mix均購自北京天根生物公司。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用SP法，實驗操作步驟嚴格按說明書進行，用陽性非小細胞肺癌切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。TNC蛋白結果判定：隨機選取5個高倍鏡視野，無陽性細胞為0分，陽性細胞占1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度：細胞外基質中TNC無表達為0分，局部斷線狀表達為1分，連線狀表達為2分，大量網格狀表達為3分。將上述兩項得分結果相加：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性()，>4分為強陽性()。統計學處理時將≥1分歸為陽性，記為“+”。USP22蛋白和Ki-67蛋白結果判定：200倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數200個細胞，計算陽性細胞占鏡下細胞的百分比：陽性細胞數<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()。統計學處理時將陽性細胞數≥10%歸為陽性，記為“+”。

1.4 RT-PCR 按照TRIZOL試劑說明書提取TNC、USP22、Ki-67在非小細胞肺癌組織中的總RNA。TNC引物序列：上游5′-CTGTCACCGTGTCAACCTGA-3′，下游5′-TATCCCAA CATTCCCCGCTT-3′；USP22引物序列：上游5′-CCATCTTT GTCCGGCCTCC-3′，下游5′-CCAACGCCTTGCATTTTC CA-3′；Ki-67引物序列：上游5′-CTTTGGGTGCGACTTGAC GA-3′，下游5′-TTCTGCCATTACGTCCAGCG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游5′- GTGATCTC CTTCTGCATCCTGT-3′。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性25 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33次循環；72 ℃終延伸5 min。使用2.0%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳分析。

1.5 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，兩組之間的差異采用χ2檢驗，采用Spearman秩相關性比較，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNC、USP22及Ki-67蛋白在正常肺組織和非小細胞肺癌組織中的表達 TNC蛋白主要表達于非小細胞肺癌巢周圍細胞外基質、基膜，呈細條狀棕黃色或棕褐色區(圖1A、B)，在肺腺癌和鱗狀細胞癌中的陽性率分別為73.07%(19/26)和75.00%(15/20)，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。USP22蛋白主要表達于非小細胞肺癌細胞胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1C、D)，在肺腺癌和鱗狀細胞癌中的陽性率分別為69.23%(18/26)和70.00%(14/20)，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。Ki-67蛋白主要表達于非小細胞肺癌細胞胞核，部分細胞胞質也呈陽性反應并呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1E、F)，在肺腺癌和鱗狀細胞癌中的陽性率分別為61.53%(16/26)和75.00%(15/20)，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2 TNC、USP22及Ki-67蛋白表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系 TNC蛋白高表達與非小細胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學分類無關(P>0.05)，與非小細胞肺癌淋巴結轉移、分化程度和臨床分期相關(P<0.05，表1)。USP22和Ki-67蛋白高表達均與非小細胞肺癌淋巴結轉移、分化程度和臨床分期呈正相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學分類均無關(P>0.05，表1)。

2.3 TNC、USP22及Ki-67 mRNA在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌組織中的表達 肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中TNC、USP22和Ki-67 mRNA表達均增強，與正常對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)；而肺腺癌組和肺鱗狀細胞癌組相比，TNC、USP22及Ki-67 mRNA的表達強度差異均無統計學意義(P>0.05，圖2)。

3 討論

TNC是細胞外基質中具有獨特六臂結構的寡聚糖蛋白，在胚胎期一過性高表達，至機體發育成熟表達減弱，具有創傷修復、調節腫瘤細胞增殖、分化等作用。研究顯示TNC在多種惡性腫瘤如乳腺癌、腸癌、非小細胞肺癌及前列腺癌等腫瘤中均高表達，且表達強度與腫瘤浸潤轉移有關。最近有關TNC在非小細胞肺癌中的研究已有報道，2014年葛忠虎等[5]展開了TNC在非小細胞肺癌中的病理研究，并分析得出TNC表達與非小細胞肺癌的分類、腫瘤直徑和病理分級無關，與TNM分期、有無胸膜浸潤及淋巴結轉移有關，推測TNC表達可能有助于非小細胞肺癌的侵襲和轉移。然而，關于TNC在非小細胞肺癌中過表達與其浸潤轉移的機制卻知之甚少。2015年Tang等[6]發現TNC可與細胞表面黏附分子整合素αvβ3結合，激活αvβ3-KRAS-rALB-NFκB信號通路并促進肺腫瘤的浸潤轉移。2017年Gocheva等[7]提出通過CRISPR介導的內源基因轉錄激活，可增加TNC表達水平，促進肺腺癌細胞的轉移擴散，且TNC表達越高肺腺癌的預后越差。本實驗檢測了TNC在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中的表達，并分析其表達與非小細胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度、臨床分期以及組織學分類的相關性。RT-PCR和免疫組化結果均顯示TNC在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中表達差異無統計學意義，提示TNC表達與非小細胞肺癌組織學分類無關。同時本實驗結果表明，TNC高表達與非小細胞肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小無關，而與淋巴結轉移、分化程度及臨床分期有關，且分化程度越高、臨床分期越早TNC表達越強，這一結論與葛忠虎等[5]在非小細胞肺癌中的研究結果一致，表明TNC表達增強對于非小細胞肺癌的浸潤轉移具有一定的抑制效應。本實驗亦發現TNC主要表達于非小細胞肺癌巢周邊細胞外基質及基膜，提示間質中TNC的聚集可能是抑制非小細胞肺癌細胞浸潤轉移的重要屏障，這一結論已經在乳腺導管癌、結直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的研究中得到證實。可見，檢測TNC表達對判斷非小細胞肺癌患者的惡性程度及預后有重要意義。

ABCDEF

圖1 TNC、USP22及Ki-67蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達，SP法：A.TNC在肺鱗狀細胞癌中高表達，定位于細胞外基質、基膜；B.TNC在肺腺癌中高表達，定位于細胞外基質、基膜；C.USP22在肺鱗狀細胞癌中高表達，定位于細胞核；D.USP22在肺腺癌中高表達，定位于細胞核；E.Ki-67在肺鱗狀細胞癌中陽性，定位于細胞核；F.Ki-67在肺腺癌中陽性，定位于細胞核

表1 TNC、USP22及Ki-67蛋白表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

圖2 TNC、USP22及Ki-67 mRNA在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌組織中的表達：A.RT-PCR的典型電泳結果；B.3次獨立實驗的單因素方差檢驗；與對照組相比，**P<0.01

USP22是一種調控腫瘤發生、發展的去泛素酶，研究報道USP22與人轉錄復合物SAGA(human Spt-Ada-Gcn5-acet-yltransferase)的亞單位結合，促使SAGA乙酰化染色體上的組蛋白(H2A、H2B)，激活基因的轉錄，促進細胞由G1/S、G2/M期過渡，促使腫瘤發生、發展及轉移[8]。USP22可促進多種惡性腫瘤細胞增殖，為腫瘤預后不良基因。Xiao等[9]發現USP22高表達可促進鼻咽癌細胞活力和增殖，miR-34B可通過靶向調控USP22抑制鼻咽癌細胞增殖。Okamoto等[10]通過敲除USP22基因，降低USP22的表達，抑制惡性胸膜間皮瘤細胞的體外增殖。Zhang等[11]研究證實USP22在骨肉瘤中高表達，下調USP22基因表達后，可抑制骨肉瘤細胞增殖并阻滯細胞周期。本組中RT-PCR和免疫組化結果均提示，與正常對照組相比，非小細胞肺癌組織中USP22蛋白和mRNA表達均增強，差異有統計學意義，并且淋巴結出現轉移、分化程度越低、臨床病理分期越晚時，USP22表達越強。提示USP22高表達可能使非小細胞肺癌細胞增殖調控受到影響，從而導致非小細胞肺癌細胞異常增殖。本實驗中，中分化組USP22的陽性率顯著高于低分化組，可能是由于樣本量不足，還需要后期增加每組樣本量繼續進行深入分析。可見USP22高表達是非小細胞肺癌發生的重要機制之一。

細胞增殖失控是惡性腫瘤發展的標志，Ki-67是一種反應細胞增殖活性的特異性核抗原。近來研究表明，Ki-67在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移中起關鍵性作用。關于非小細胞肺癌中Ki-67表達與臨床病理特征的關系已被廣泛研究，且爭議頗多。袁艷龍等[12]對79例非小細胞肺癌組織和20例肺良性病變組織分析發現Ki-67表達與非小細胞肺癌分化程度、臨床分期及淋巴結轉移明顯相關，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型等無明顯相關性。Wen等[13]對5 600例非小細胞肺癌患者進行Meta分析，證實在亞洲非小細胞肺癌患者中Ki-67高表達與患者年齡和淋巴結轉移無關，與患者性別、臨床分期、分化程度顯著相關。Warth等[14]對1 065例非小細胞肺癌患者進行回顧性分析，發現Ki-67增殖指數與組織學亞型有關。本實驗中Ki-67在非小細胞肺癌中高表達與淋巴結轉移、分化程度和臨床分期呈正相關，與患者年齡、性別、腫瘤大小和組織學分類無關，與袁艷龍等[12]在非小細胞肺癌中的研究結果一致，而與Wen等[13]的研究結果不完全一致。原因可能是由于此次非小細胞肺癌標本量不足，仍需加大樣本量深入探討。

本實驗亦發現USP22與Ki-67的表達呈正相關，提示USP22與Ki-67兩者可能在非小細胞肺癌中相互作用，共同促進細胞增殖，這一結論已經在食管鱗癌中得到證實[8]。但仍需進一步實驗證實非小細胞肺癌中兩者之間的關系。隨著對腫瘤浸潤轉移研究的逐漸深入，有效的將TNC與USP22及Ki-67的指標聯合檢測，并探討三者在非小細胞肺癌浸潤轉移中的相互作用機制，有望為非小細胞肺癌的治療及預后提供新思路。