非小細胞肺癌中KiSS-1、MMP-2和MVD的表達及意義

趙天源，常延河，張艷敏，夏彥東

肺癌是對人類威脅極大的惡性腫瘤，其發病率和病死率位居全球前列[1]，腫瘤轉移是造成患者預后不良的主要原因，其是由多基因、多步驟共同參與的過程。本實驗旨在探討腫瘤轉移抑制基因親吻素-1(kisspeptin 1, KiSS-1)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和微血管密度(microvessel density, MVD)(采用CD34標記腫瘤血管而測定)在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表達及與預后關系，尋找一種可靠的能早期預測肺癌轉移和判斷預后的指標，以期為臨床提供有效的診斷預測指標和新的治療干預靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年1月～2013年5月河北省唐山市開灤總醫院診治的97例NSCLC患者，患者均經手術、支氣管鏡等病理診斷確診，臨床資料完整，術前均未行放、化療及免疫治療；其中男性74例，女性23例；年齡42～80歲，中位年齡61歲；鱗癌53例，腺癌44例；無淋巴結轉移者32例，有淋巴結轉移者65例；腫瘤臨床分期采用國際抗癌協會1997年公布的NSCLC TNM分期標準：Ⅰ期18例，Ⅱ期33例，Ⅲ期30例，Ⅳ期16例。另選取同時期就診的20例肺良性病變患者作為對照組。NSCLC組和對照組均禁食10～20 h，于術前1天清晨及術后第10天清晨抽取肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，分離新鮮血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體KiSS-1、MMP-2、CD34及ELISA試劑盒，均購自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法 采用ELISA法檢測97例NSCLC和20例肺良性病變患者血清中MMP-2的水平并嚴格按試劑盒說明書進行操作，加稀釋液于96孔板中，加樣，孵育2 h，緩沖液清洗，加MMP-2結合物，加底物，加終止液。檢測結果用酶標儀測定。

1.3.2 免疫組化 將97例NSCLC和20例肺良性病變患者手術切除標本石蠟包埋，常規脫蠟、水化，3%雙氧水，微波抗原修復，10%正常羊血清封閉；分別滴加1 ∶200的KiSS-1、MMP-2和CD34抗體，4 ℃過夜，滴加辣根過氧化酶標記兔抗人IgG，37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對照，取陽性對照片作為陽性對照。

1.4 判斷標準 KiSS-1和MMP-2判定標準：KiSS-1胞質呈棕黃色為陽性；MMP-2胞膜或胞質呈棕黃色為陽性；采用陽性細胞百分比和著色強度進行綜合判斷。(1)按陽性細胞百分比計分：≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；(2)按細胞染色強度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相加：<3分為陰性，≥3分為陽性。

CD34陽性為血管內皮細胞胞質呈淺棕色至深棕色。MVD計數標準(采用Weidner計數標準)：先在顯微鏡低倍視野下找到3個微血管密集區，然后在高倍視野下計數CD34陽性的微血管數。同一張切片計數3個高倍視野，其結果取3次平均值。所有切片均采用雙盲法閱片。

2 結果

2.1 NSCLC中KiSS-1、MMP-2和MVD的表達 KiSS-1在對照組中均呈陽性，在NSCLC組中的陽性率為49.48%(48/97)。KiSS-1在NSCLC的Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組中的表達與Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型和分化程度無關。

最終建立了去皮減毒工藝相關系數模型的具體參數為：6張典型雷公藤去皮凈制完全的打粉樣本NIR光譜，取其平均作為參比光譜（take average as reference）；數據預處理方法（data preprocessing）二階導數，平滑點數設置為9；光譜范圍5800 cm-1～5500 cm-1，4400 cm-1～4200 cm-1；不排除 CO2區域；平均相關系數 （average threshold）＞90%認為凈制完全，去皮減毒工藝水平較好。

MMP-2在對照組中呈陰性，在NSCLC組中的陽性率為52.58%(51/97)。MMP-2在腫瘤直徑>3 cm、腺癌組、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組中的表達與腫瘤直徑≤3 cm、鱗癌組、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、肺癌分化程度無關(P>0.05)。

CD34高表達于血管內皮細胞，周圍組織不著色。CD34標記的血管數：20例對照組中微血管數為(24.90±10.46)條，實際范圍5～41條；97例NSCLC組中微血管數為(59.20±18.23)條，實際范圍19～109條。NSCLC組與對照組之間的MVD差異有顯著性(t=-11.500，P<0.01)，MVD在Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組數量高于Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組；與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型和分化程度無關(表1，圖1～6)。

2.2 NSCLC中血清MMP-2的表達 NSCLC術前組血清MMP-2表達水平[(530.83±57.21)ng/mL]顯著高于NSCLC術后組[(260.25±23.20)ng/mL]和對照組[(242.16±30.43)ng/mL](P<0.05)。NSCLC術后組血清MMP-2表達與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。

MMP-2在腫瘤直徑>3 cm、肺腺癌組、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移組中的表達與腫瘤直徑≤3 cm、肺鱗癌組、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移組相比，差異有顯著性(P<0.05)。MMP-2表達與患者性別、年齡、分化程度無關(P>0.05，表2)。

2.3 NSCLC中血清MMP-2水平與組織MMP-2蛋白表達的相關性 NSCLC組織中MMP-2蛋白陽性者，其血清MMP-2水平高于MMP-2蛋白陰性者(P<0.05，表3)。

2.4 NSCLC組織中KiSS-1、MMP-2、MVD表達和術后生存率的關系 根據免疫組化表達結果將NSCLC組分為KiSS-1陰性組和KiSS-1陽性組，Kaplan-Meier生存曲線提示：KiSS-1陽性者術后5年生存率(9.28%)顯著高于陰性者(1.03%)(P<0.01)。

根據免疫組化結果將NSCLC組分為MMP-2陰性組和MMP-2陽性組，Kaplan-Meier生存曲線提示：MMP-2陽性者術后5年生存率(2.06%)顯著低于陰性者(8.25%)(P<0.01)。

①②③④⑤⑥

圖1 KiSS-1在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖2 KiSS-1在肺腺癌組織中呈陽性，SP法 圖3 MMP-2在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖4 MMP-2在肺腺癌組織中呈陽性，SP法 圖5 CD34在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖6 CD34在肺腺癌組織中呈陽性，SP法

圖7 KiSS-1(A)、MMP-2(B)和MVD(C)的表達水平與非小細胞肺癌患者5年生存率的關系

表2 術前血清MMP-2水平與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

表3 非小細胞肺癌組織和血清中MMP-2表達的相關性

3 討論

腫瘤轉移是腫瘤細胞與宿主細胞之間多種分子和基因相互作用的結果，是多步驟參與的過程；其中突破基膜是轉移的首要環節。MMP-2作為基質金屬蛋白酶家族中的重要成員之一，能夠特異性的降解基膜和結締組織等細胞外間質(Ⅳ型膠原和層黏蛋白)[2]，從而降低細胞之間的黏附作用，促進腫瘤細胞的遷移。焦娟等[3]研究表明，三陰型乳腺癌對MMP-2通路進行活化，從而達到促進腫瘤浸潤轉移的目的。以往的實驗標本通常為一種組織，而本實驗采用免疫組化法和ELISA法同時對癌組織和血清中MMP-2的水平進行測定，并獲得一致性結果：NSCLC患者術前MMP-2的表達水平顯著高于肺良性病變患者和術后的表達水平(P<0.05)；MMP-2表達與腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結有無轉移密切相關。這與Ali等[4]把血清MMP-2水平作為評價腫瘤惡性程度的有效指標觀點相符。本實驗采用兩種方法聯合檢測提高了實驗結論的準確性及可信度，且外周血取材簡便易行，更易推廣應用。

表4 KiSS-1、MMP-2、MVD表達與非小細胞肺癌患者5年生存率的關系

閆鐵夫等[5]的研究結果表明，腫瘤細胞的浸潤和轉移需要大量新生血管的形成。CD34是與新生血管內皮細胞增殖有關的蛋白，常作為腫瘤MVD的標志物，目前已將MVD作為評估腫瘤血管形成的重要標準[6]。本實驗采用免疫組化法計數20例對照組肺組織和97例NSCLC患者的微血管數量，結果顯示：NSCLC組與對照組之間的MVD差異有顯著性(P<0.01)，且MVD與腫瘤TNM分期和淋巴結有無轉移相關(P<0.01)。進一步分析與5年生存率的關系，結果顯示：微血管數高組肺癌患者術后5年生存率(4.12%)顯著低于低組(6.19%)(P<0.01)。上述結果提示微血管計數有助于判斷患者的預后情況，與唐智等[7]認為微血管數可以用來評估鼻腔(竇)鱗狀細胞癌預后的結論相符。

王洪興等[8-9]的研究結果表明KiSS-1對胃癌細胞株的侵襲和轉移有明顯抑制作用。Wang等[10]研究發現分化良好、腫瘤體積小、無淋巴結轉移的膽囊癌KiSS-1的表達顯著高于分化差、腫瘤體積大、并伴浸潤和轉移的膽囊癌。KiSS-1在肺癌中的表達，尤其是與患者術后生存期的關系，國內外較少報道。本實驗結果顯示：KiSS-1表達與NSCLC臨床TNM分期、淋巴結有無轉移有關(P<0.05)。對NSCLC患者進行5年生存期分析發現，KiSS-1陽性者術后5年生存率(9.28%)顯著高于陰性者(1.03%)(P<0.01)。

綜上所述，KiSS-1、MMP-2和MVD與NSCLC的轉移和預后密切相關，三者可作為腫瘤惡性程度的評判指標和基因治療的靶點，并對患者生存期的預測提供一定的幫助。