FISH技術在PML/RARA融合基因檢測中的應用體會

羅秋萍

急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)的一種特殊類型(M3)，其臨床特點是出血傾向嚴重，常易并發彌散性血管內凝血及原發性纖溶亢進，早期病死率高，所以APL的早期診斷和及早治療至關重要。現已明確t(15；17)是APL的特征性染色體異常，并在分子水平上導致PML/RARA融合基因的形成[1]。對APL患者進行PML/RARA融合基因的檢測具有重要的臨床價值，可為患者的診斷、療效和預后提供有效幫助。采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術對PML/RARA融合基因進行檢測，具有成功率高、準確、省時，對檢測標本限制低等優點[2]。因此，如何確保FISH的制片質量顯得尤為重要。本科室經實踐總結經驗，對一些操作細節進行了改進，效果顯著，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集廣州醫科大學附屬第三醫院病理科2017年1月～2018年10月診斷的64例骨髓或外周血標本。

1.2 主要試劑 氯化鉀、甲醇、冰乙酸、胃蛋白酶、HCl、無水乙醇、2×SSC溶液、NP-40溶液，探針選用廣州安必平醫藥公司的PML/RARA融合基因檢測試劑盒(粵食藥監械生產許20111993號)。

1.3 主要儀器 徠卡顯微系統(DM4B)，恒溫水浴箱，離心機，恒溫烤箱，美國雅培StatSpin ThermoBrite自動原位雜交儀。

1.4 染色方法 (1)取骨髓或外周血2～3 mL(肝素鈉抗凝)1 000 r/min離心12 min，用巴氏試管吸取中間的白膜層；(2)將吸取的白膜層細胞加入37 ℃水浴箱中提前預熱的低滲液中(0.075 mol/L，5 mL)，吹打混勻，于37 ℃水浴箱中低滲8 min；(3)往細胞低滲液中加入2 mL固定液(甲醇 ∶冰乙酸為3 ∶1)，吹打混勻后離心(1 000 r/min，12 min)；(4)去上清，加入5 mL固定液，吹打混勻后離心；(5)重復以上洗滌步驟，直至細胞沉淀呈白色，加入新鮮固定液，于4 ℃冰箱固定過夜；(6)第2天離心后去上清，根據細胞沉淀量加入合適新鮮固定液，吹打混勻后靜置1 min，取10 μL細胞懸液分別滴加到3張干凈載玻片上；(7)58 ℃恒溫烤箱中烤片120 min以上；(8)在相差顯微鏡下選取細胞密度合適的玻片，并在玻片合適位置劃出雜交區域，以方便后續操作；(9)將玻片放入胃蛋白酶工作液中消化4 min[工作液配制：50 mL純化水中加入500 μL的HCl(1 mol/L)，置于37 ℃恒溫水浴箱中預熱，使用前加入3 μL 胃蛋白酶濃縮液(20 mg/mL)]；(10)取出玻片，將其放入10%中性福爾馬林/PBS固定液中，室溫固定4 min；(11)取出玻片置于2×SSC溶液中洗滌5 min；(12)取出玻片置入70%、80%、100%梯度乙醇中脫水各2 min，取出玻片，室溫自然干燥；(13)避光環境中，加探針后放入自動原位雜交儀中進行雜交(78 ℃變性2 min，37 ℃雜交10～18 h)；(14)第2天移去蓋玻片，置于48 ℃預熱的2×SSC溶液中洗滌4 min；(15)取出玻片置于48 ℃預熱的NP-40溶液中洗滌4 min；(16)取出玻片置于70%乙醇，脫水3 min，取出玻片，室溫自然干燥；(17)室溫滴加DAPI復染液，使用熒光顯微鏡進行觀察判讀。

1.5 結果判讀 熒光顯微鏡下GSP PML探針顯示綠色信號，GSP RARA探針顯示紅色信號，若細胞顯示為2紅、2綠分散存在的熒光信號，則判定為陰性；典型陽性信號為1紅、1綠、2黃，當出現2個以上或以下紅色或綠色信號表示該基因拷貝數增多或丟失。

2 結果

本實驗FISH法檢測結果顯示，64例標本中有57例標本獲得高強度清晰的熒光信號(圖1)；5例標本因滴片細胞密度過高，細胞堆積在一起，細胞核上、核外雜信號較多，影響判讀(圖2)；2例標本因未進行胃蛋白酶消化處理，整張玻片出現模糊和云霧狀的背景(圖3)。

3 討論

FISH是一項在體外直接觀察細胞中特定的核酸技術，原理是利用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸[3]。FISH檢測的關鍵是清晰地觀察到熒光雜交信號，但在激發光照射下，標本背景成分(如核蛋白、胞質蛋白、膠原纖維等)均可產生非特異性背景熒光(未洗除的熒光素標記探針也包含在內)，一旦背景熒光過強，則會影響目標熒光信號的判讀。因此，FISH檢測的關鍵除了保證雜交成功外，還需減弱背景熒光，增強目標熒光信號，即提高信噪比[4]。作者在實踐中發現，細節操作的改進可以提高信噪比，主要有以下幾點：(1)確保白細胞收集的質量：有文獻報道白細胞的收集是直接離心去上清后加入0.075 mol/L低滲液，低滲后加入固定液反復清洗直至細胞沉淀呈白色[5]。雖然肉眼可見細胞沉淀呈白色狀態，但由于帶入血液標本中的紅細胞，即使紅細胞被裂解，但殘留的細胞碎片會產生較多的非特異性背景熒光。肝素鈉抗凝的骨髓或外周血標本經過離心，由于比重不同，會出現分層現象，上層淡黃色半透明液體為血漿，中間薄薄一層白色物質為白細胞和血小板，下層暗紅色不透明的為紅細胞。PML/RARA融合基因的檢測只需要收集白細胞，所以實驗中只吸取中間的白膜層即可，減少紅細胞的帶入，降低非特異性背景熒光。(2)細胞懸液制備過程的離心速度是關鍵：多數文獻報道制備細胞懸液時離心速度一般為1 500～2 000 r/min[5-6]。本科室總結多年經驗發現細胞核在未徹底固定好的情況下，進行高速離心，可能會發生損壞，直接導致熒光雜交信號分散不集中，甚至無法判讀，且這種信號分散的情況是不可逆的[7]。所以細胞懸液制備過程中一般會將離心速度設定在1 000 r/min，離心時間相對延長(12 min)。(3)制片質量：取1張干凈的載玻片，重懸細胞后取合適懸液滴加到載玻片上，室溫晾干后用10×物鏡在相差顯微鏡下觀察細胞密度，要求細胞無重疊，且單視野細胞數量在100～200個為宜，如細胞密度不合適，則根據要求重新制片。若細胞重疊較多，影響信號判讀，同時容易影響消化效果產生較多信號雜點；若細胞密度過低，計數達不到100個細胞，同樣會影響判讀。(4)胃蛋白酶消化時間的把握：玻片在進行雜交前一般需要進行胃蛋白酶的消化處理，消化的目的是通過微小組織蛋白降解，可增加細胞的滲透性從而增加探針的穿透力。如果消化不足會使核酸無法充分暴露，而消化過度則會破壞核酸周圍的蛋白結構，導致后續步驟中核酸的丟失[8]。骨髓或外周血標本與石蠟組織切片標本的最大區別：前者細胞分散存在，細胞之間沒有過多交聯。消化處理的酶一般選用胃蛋白酶，并且濃度相對較低，消化時間可按預試驗進行調整。一般消化完成的細胞可在未加探針之前，使用熒光顯微鏡DAPI通道進行觀察，以便及時了解消化效果。消化程度適當的細胞核亮度合適、核膜完整、邊緣光滑，通過微調感覺到細胞有立體感，核表面有明顯的凹凸不平感，視野清晰；如果細胞核亮度灰暗，產生黑洞和孔狀，核膜呈鋸齒狀一般視為消化過度；如果細胞核亮度刺眼，通過微調，細胞立體感不強，細胞視野比較模糊、輪廓不清、表面有云霧狀一般視為消化不足[9]。(5)后固定的必要性：細胞片經胃蛋白酶消化后，采用10%中性福爾馬林/PBS固定液進行后固定，固定時間4～5 min。后固定的主要目的是防止核酸在消化處理后，在后續的實驗步驟中丟失，同時可以使雜交信號更加集中清晰，利于觀察判讀。如果后固定液的濃度過高或固定時間過長，則有可能會使蛋白重新發生交聯，令雜交信號背景升高，不利于信號觀察判讀[7]。

①②③圖1 PML/RARA融合基因:細胞散在分布,紅綠信號清晰明顯,油鏡 圖2 PML/RARA融合基因:細胞重疊堆積在一起,細胞核上、核外雜信號較多,油鏡 圖3 PML/RARA融合基因:整張玻片出現模糊和云霧狀的背景,紅綠信號強度尚可,油鏡

綜上所述，在FISH實驗中影響熒光信號的因素較多，要制出一張高質量的FISH切片，需要準確把握每一步驟的實驗條件，并謹慎操作。