改良六胺銀染色法在真菌染色中的應用

邢 杰，吳佳君，葉 敏，秦 鋼，趙蘭香，余科科，張 杰，韓昱晨

近年來，隨著廣譜抗生素的濫用、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的廣泛使用，加之外科介入性治療的不斷發展與成熟，使得系統性真菌感染在原有的基礎上日益增多。尤以肺部真菌感染位居首位，超半數的真菌感染會侵犯支氣管、肺部，然而其癥狀和影像學表現均缺乏特異性，因此在病理上準確診斷出真菌感染顯得極其重要[1-4]。隨著診斷試劑盒不斷的更新，雖然染色方法越來越簡便，效果也越來越好，但同時也導致越來越多的技術員并不能很好的理解六胺銀特殊染色方法的原理和過程。上海交通大學附屬胸科醫院病理科至今仍然使用手工配制試劑進行染色，并且不斷改良配方，取得了很好的效果，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機選取2016年上海市胸科醫院病理科存檔的六胺銀陽性病例20例，為保證實驗結果評價的一致性，均選用手術切除標本。每例標本連續切片3張，分別用于原六胺銀試劑染色、改良六胺銀試劑染色、六胺銀試劑盒染色。

1.2 試劑配制 六胺銀染色試劑盒購自Baso公司。六胺銀染色試劑的配制[5]：(1)高碘酸溶液(原方法使用0.5%高碘酸溶液，改良法使用1%高碘酸溶液)；(2)六胺銀儲備液的配制，將3%六次甲基四胺水溶液100 mL加入到5 mL的5%硝酸銀溶液中即形成白色沉淀，搖動可使沉淀立即溶解，澄清后放置于4 ℃冰箱中保存；(3)六胺銀工作液的配制，將3 mL 5%的四硼酸鈉加入到25 mL的蒸餾水中混合均勻，然后加入15 mL的六胺銀儲備液，攪拌混合均勻后即可使用；(4)1%氯化金水溶液；(5)2%硫代硫酸鈉水溶液；(6)1%中性紅染液(原方法使用1%中性紅復染，改良法使用伊紅復染)。

1.3 染色步驟 將三種六胺銀染色方法進行比較(表1)。

1.4 結果分析 閱片方法：三種方法染色的切片分別由病理科兩位主治醫師和一位副高級醫師進行判讀和評分，并且所有切片隱藏病歷號等常規使用的編號，因此參加判讀的三位醫生事先對切片的結果并不知曉。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，使用χ2檢驗對三位醫師的判讀結果和評分進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

改良六胺銀試劑所染色的切片(圖1)染色效果較好，與六胺銀試劑盒染色結果(圖2)差異無顯著性(P=0.766)，原六胺銀試劑所染色的切片(圖3)，雖然能夠區別陽性和陰性，但染色效果與六胺銀試劑盒染色效果相比差異有顯著性(P=0.005)，并且與改良六胺銀染色效果相比差異有顯著性(P=0.028，表2)。

①②③圖1 改良六胺銀試劑染色的效果 圖2 六胺銀試劑盒染色的效果 圖3 原六胺銀試劑染色的效果

3 討論

真菌內的多糖化合物能夠被酸氧化而暴露醛基，醛基能夠將六胺銀還原為黑色的金屬銀，從而在鏡下觀察到真菌。傳統的六胺銀染色方法中使用鉻酸溶液作為氧化劑，由于鉻酸氧化性較弱，后逐漸被高碘酸取代[6]。原六胺銀試劑染色法使用0.5%高碘酸將多糖化合物氧化而暴露醛基，而改良六胺銀試劑染色法使用1%高碘酸，且氧化時間也從原來的30 min增加到60 min，這種改良能夠更好的將真菌的多糖化合物酸化從而暴露醛基。溫度是六胺銀染色的重要因素，溫度必須不低于60 ℃，亦不能較高，時間不能過長，否則六胺銀易氧化變渾濁出現黑色的氧化膜[7]，因此改良六胺銀試劑染色法將溫度從原來的58～60 ℃提高到65～70 ℃，時間仍然控制在60 min。最后使用伊紅替代中性紅復染，使得被染色成黑色的真菌在伊紅的背景下更加清晰。

表1 三種六胺銀染色方法的差異比較

表2 三種染色方法結果對比

病理技術的主要工作是協助病理醫師更好的診斷，病理技術員除了熟練的掌握染色方法外，更需要熟知染色方法中的原理和過程，才能更好的掌握和熟練運用染色方法。手工配制試劑即使是在各種試劑盒不斷更新的今天，依然有助于我們熟知每一種染色方法的原理和過程，仍具有重要的意義。