淋巴結組織術中冷凍切片常見問題與對策

王 偉，朱惠君

在臨床術中送檢的快速病理標本中，淋巴結是含脂肪較多的組織之一，周圍脂肪很難剔除干凈，組織結構致密、細胞豐富，其外周又有致密結締組織的被膜包裹，難以凍結，切片呈糊狀，需要較低的溫度進行冷凍。但冷凍溫度過低，又易使淋巴結組織變脆，不能滿足鏡檢要求，極易造成漏診，與其他組織相比其制片難度較大[1]。本科室在實際工作中對術中同時送檢的多個淋巴結組織冷凍切片進行實踐和探索，取得滿意效果。鏡下觀察，淋巴結組織結構完整，胞質與胞核紅藍對比鮮明，實質細胞無收縮，與常規石蠟切片觀感結果較一致(圖1)。現就術中冷凍淋巴結組織制片中常見問題與對策進行總結，并介紹如下。

1 切片有裂隙、顫痕或碎沫樣改變

1.1 原因 多出現有腫瘤轉移或反應性增生等實質細胞改變的淋巴結組織切片，特點是淋巴結實質細胞致密，造成組織冷凍后硬度較大所致。

1.2 對策 參考臨床病理室間質控評價標準中的冷凍切片標準[2]，將恒冷切片機的箱體溫度調在適合淋巴結組織切片的最佳溫度-18～-20 ℃，將淋巴結組織置于冷凍托底座上，周圍滴加OCT包埋劑，冷凍1～2 min，6 μm厚切片，即可順利切出切片。

1.3 注意 (1)取材前應先用濾紙吸取淋巴結組織表面的水分，防止冰晶形成。(2)盡可能剔除淋巴結組織周圍的脂肪，避免脂肪過多導致切片困難。(3)防止取材手法不當或者刀鈍造成淋巴結組織擠壓受損，導致鏡下結構發生變化。(4)冷凍時間亦不宜過長，否則實性成分容易過度冷凍，切片易產生皺褶、發脆。

2 組織切片呈糊狀，堆積在一起或者黏附在切片刀上，難以展平

2.1 原因 脂肪組織所含水分極少，難以像其它組織一樣被凍硬，所以被脂肪成分包裹的淋巴結組織易皺褶、卷曲、黏稠不成片。通常箱體溫度在-18 ℃左右，樣品頭溫度-20 ℃左右，這樣就能將一般的組織切出6 μm厚的平整切片。但對于被脂肪成分包裹的淋巴結組織，即使溫度調制-30 ℃，脂滴也不易被凍硬，很難切出滿意的切片。

2.2 對策 取材時盡可能把淋巴結周圍的脂肪組織用刀剔除干凈，或者用擠壓的方法，將被脂肪組織包裹的淋巴結組織置于多層干凈紗布之間，手指輕壓紗布中的組織，使脂肪組織中的脂質成分被擠壓出去。也可用粗切削的方式將組織粗修至最大平面后，再用冷凍錘輕壓切面，然后順著原粗修切片的方向快速切片，也取得較好效果。

2.3 注意 (1)含脂質較多的淋巴結組織容易掉片，切片厚度不宜超過6 μm，且切片過厚會導致細胞重疊，鏡下結構不清晰。(2)用擠壓的方法盡量保持組織原有形態，減少組織受壓引起損傷，結構發生變化。(3)采用全新的優質一次性不銹鋼刀片，最好不用檔板，直接快速切片，可以減少刀片和冷凍組織摩擦時產生的熱量，慢搖切片機使細胞容易堆積、重疊。

3 切片時組織脫落、脆裂，不完整，切面常有空洞，部分糊狀

3.1 原因 既有實性成分又有脂肪成分的多個淋巴結組織，則切出的薄片空洞，破碎，切片不完整，切片困難(圖2)；要切出脂肪，需在低溫下才能使脂肪冷凍，且耗時較長，而溫度太低，實性部分往往容易過度冷凍。

3.2 對策 使用適當的包埋方法，將恒冷切片機的箱體溫度調為-18 ℃，同時將實性成分和脂肪成分為主的淋巴結組織分別包埋固定在一樣品頭的上、下方，兩者盡可能緊靠，實性成分擺在凍頭下方，靠近刀口的位置；脂肪成分擺在凍頭的上方，遠離刀口的位置，這樣先切實性部分，用毛筆輕拉切片，有利于展平上方的組織。否則兩種成分混合冷凍在1個凍頭上，難以切完整，易形成大的空洞。也可預先在淋巴結組織大體檢查時，通過肉眼觀察將含實性成分和脂肪成分的淋巴結組織分開冷凍固定在2個凍頭上，然后分別按照上述1.2和2.2的對策處理即可，減少人為的空洞現象，能順利切出滿意切片(圖3)。

使用術中印片細胞學檢測[3]，將術中新鮮淋巴結組織直接放在紗布上，用解剖刀沿淋巴結的最大面剖開，或者在冷凍機的樣品頭上粗修至最大平面，然后將準備好的干凈防脫膠載玻片立即對著病灶明顯的剖面或最大平面，印片4～6張(圖4)，隨即固定，染色即可，操作簡便，能真實反映細胞形態，診斷準確性高。與冷凍組織切片的診斷符合率相似，有助于病理醫師發出臨時報告。

①②③④

圖1 淋巴結組織術中切片鏡下觀與常規HE觀感相似 圖2 淋巴結組織切成糊狀，空洞，不完整 圖3 切出較完整的淋巴結切片 圖4 印片細胞學方法制片

3.3 注意 印片時動作輕柔、用力均勻，不能來回摩擦，否則會導致細胞重疊影響診斷。有研究報道[3]，用該方法制成的淋巴結組織術中切片和常規石蠟制片的準確率相似，對印片細胞學在淋巴結組織術中診斷中的地位給予充分的肯定，但是該方法對診斷淋巴結微轉移尚有缺陷。建議可在因制片時間有限，且難以按上述方法切出理想切片時考慮該方法。

4 送檢多個淋巴結組織切不完整，造成漏診

4.1 原因 大小不一、圓形或橢圓形等多個淋巴結組織，因切片時高度不在一個平面上，造成較小淋巴結的誤、漏診。

4.2 對策 將較小的和較大的淋巴結組織分開包埋，將較小的淋巴結組織單獨制作一個OCT包埋托，先滴加OCT包埋劑，做成一個凍臺，再把淋巴結組織包埋進其中，排列不能太分散，以利于切片。然后將較大的淋巴結組織冷凍在另一個樣品頭上，隨后分別切片，常規冷凍切片HE染色。如遇疑難制片，再按上述方法處理。

4.3 注意 (1)為減少或避免發生誤、漏診，需將淋巴結組織同時切完整。(2)在提高淋巴結組織制片質量的基礎上，多做幾個切面的冷凍切片，以滿足病理醫師的診斷要求。

綜上所述，針對術中冷凍中淋巴結組織不同情況應采取不同方法，當遇到切片問題，按上述操作方法解決后，有利于制作出較為滿意的淋巴結切片，便于術中快速冷凍病理診斷及后續手術方案的選擇。