不孕癥患者致病基因TUBB8新型突變位點的篩查及分析

林 靜， 孫曉溪， 王 磊

1. 復旦大學附屬婦產科醫院，上海集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011 2. 上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室，上海 200011 3. 復旦大學生物醫學研究院，上海 200032

不孕癥影響著世界范圍內8%～12%的育齡人口[1]。40多年來，輔助生殖技術已經取得了巨大進展，但是臨床上仍然有部分不孕癥病例既沒有找到病因也沒有找到醫治方法。目前，越來越多與不孕相關的基因和易感致病位點被篩選出來，如與透明帶形成相關的ZP1、ZP2、ZP3[2]、與卵子死亡相關的PANX1[3]、與卵母細胞成熟相關的PATL2[4]和TUBB8[5]、與受精相關的WEE2[6]、與胚胎發育相關的TLE6[7]和PADI6[8]等。本研究將利用Sanger測序技術對收集的不孕癥患者進行TUBB8的篩查，明確患者的致病突變，分析新的突變位點和突變表型。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2018年1月至2019年6月于上海集愛遺傳與不育診療中心接受輔助生殖技術治療的不孕癥患者23例。納入標準：正常性生活1年以上未避孕未孕的已婚夫婦。排除標準：已知染色體異常、放化療、其他可能導致女性不孕的生殖系統疾病、男方因素等其他明確原因導致的不孕。本研究通過上海集愛遺傳與不育診療中心倫理委員會批準(倫研批第148號)，參與研究的患者以及能提供血液樣本的患者親屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 提取基因組DNA 收集患者及患者親屬的空腹靜脈血5 mL，采用血液DNA提取試劑盒(Magen，美國)對研究對象的外周血樣本進行基因組DNA提取。

1.3 Sanger測序 針對人TUBB8(NM_177987.3)的外顯子區域分段設計引物，引物序列如表1所列。以研究對象的外周血基因組DNA為模板，用Taq PCR預混液(上海萊楓生物科技有限公司，中國)配制PCR反應體系。反應程序分為2階段，第一階段設置：98℃預變性3 min，98℃變性10 s，68℃退火15 s(設置12個循環，每個循環退火溫度下降0.5℃)，72℃延伸30 s；第二階段設置：98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，設置30個循環，最后72℃延伸2 min。擴增完成后，將PCR產物送上海鉑尚測序公司進行Sanger測序。

表1 TUBB8基因的引物序列

1.4 突變預測 使用SIFT(http://sift.bii.a-star.edu.sg/)和PROVEAN(http://provean.jcvi.org/)工具對突變位點進行有害性評估。利用人類外顯子組數據庫ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)和基因組突變頻率數據庫gnomAD(http://gnomad.broadinstitute.org/)查找突變位點的頻率。

2 結 果

2.1 基因測序結果 通過Sanger測序發現2例攜帶TUBB8基因突變的患者。如圖1所示，1號家系患者TUBB8上存在雜合錯義突變c.550A>G(p.N184D)，其父親為攜帶者，而母親正常，說明該突變遺傳自父親(圖1)。2號家系的患者存在另一個雜合錯義突變c.267C>A(p.N89K)，經檢測，父母TUBB8基因均正常，說明該突變是新發的(圖1)。TUBB8基因突變位點信息見表2。PROVEN和SIFT算法預測提示，突變c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)均為有害突變(表2)。

圖1 攜帶TUBB8基因突變的2個家系及測序驗證

2.2 患者臨床信息 攜帶TUBB8基因突變的2例患者均有多年原發不孕病史，接受過1次輔助生殖技術治療，未獲得有效胚胎。2例患者的卵子和胚胎情況見表3。1號家系的患者為32歲，在IVF/ICSI嘗試中獲得了11枚卵，10枚為成熟卵子并且成功受精，胚胎能發生分裂，但是未達到可移植階段。2號家系的患者年齡為38歲，總獲卵31枚(包括3枚GV卵和28枚MⅠ卵)，卵子無法受精。

表2 TUBB8基因突變位點的匯總情況

表3 攜帶TUBB8基因突變患者的卵子和胚胎情況

IVF:試管受精; ICSI:卵母細胞質內單精子顯微注射; GV:卵核泡; MⅠ:第1次(細胞分裂)中期; PB1：第一極體

3 討 論

本研究通過對不孕癥患者TUBB8的篩查，發現了2個新的雜合錯義突變：c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)，表型分別為胚胎發育阻滯和受精障礙。

2016年首次發現人類TUBB8基因突變會導致卵子減數分裂阻滯，突變造成蛋白質折疊異常，干擾細胞微管網絡的形成，破壞卵子紡錘體的組裝，進而引起卵子成熟障礙[5]。隨后多個研究[9-12]相繼發現，TUBB8的多個致病突變位點，突變類型包括：錯義突變、無義突變、移碼突變等。既往研究[10]顯示，該基因在不孕人群中的篩查陽性率高達30%。本研究發現的2個突變一個來源于可正常生育的父親，另一個為新發突變，這與之前的研究結果[11]一致。值得注意的是，有些病例中的突變可來源于母親[12]。

目前，TUBB8基因突變的表型包括：卵子成熟障礙、受精障礙、胚胎發育阻滯、胚胎種植失敗等[12]。攜帶c.550A>G(p.N184D)突變的患者卵子可受精、繼續分裂，但胚胎發育阻滯，而c.267C>A(p.N89K)突變的患者卵子不成熟、無法受精。結果提示突變位點不同會導致表型有差異。

經PROVEN和SIFT算法預測，c.550A>G(p.N184D)和c.267C>A(p.N89K)為有害突變。由于預測軟件的準確率為70%～80%[13]，突變位點的致病性尚需進一步功能學實驗驗證。此外，Sanger測序是DNA測序技術的金標準，本研究針對TUBB8基因外顯子區域進行擴增、測序，可以篩查外顯子區域的多種突變類型，但不能排除位于內含子或其他區域的突變。

綜上所述，本研究通過在不孕癥患者中篩查TUBB8，擴展了TUBB8的突變譜和表型譜，進一步證實TUBB8在卵母細胞成熟、胚胎發育中具有重要作用。