CHB 感染者經(jīng)替諾福韋聯(lián)合胸腺肽治療后miR-122 和miR-21表達(dá)的研究

梁爽，張寶*，李世龍，吳丹，牛蕊，邸寶春，王輝

（1.唐山市傳染病醫(yī)院,河北 唐山；2.唐 山 市人民 醫(yī) 院檢驗科,河北 唐山）

0 引言

慢性乙肝是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的一種嚴(yán)重危害人體健康的傳染病，其臨床特點為病程長、反復(fù)發(fā)作，并可進一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌（HCC）。據(jù)資料統(tǒng)計，我國慢性HBV 感染者約9000 萬例，其中CHB 患者約2800 萬例[1]。目前，最主要的方法是抗病毒治療，但無論是干擾素或是核苷(酸)類似物的治療，只能抑制HBV-DNA 復(fù)制，不能徹底根治CHB，療效有限[2]。本研究的目的是通過替諾福韋聯(lián)合胸腺肽治療慢性乙型肝炎，觀察臨床療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2017 年10 月至2019 年3 月于我院收治且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的96 例CHB 患者，采用隨機數(shù)表法分為對照組和觀察組，每組48 例。對照組患者中男性25 例，女性23 例，年齡19～60 歲，平均(39.45±8.51)歲，病程2～26 年，平均(11.3±2.2)年。觀察組患者中男性28 例，女性20 例；年齡21～58 歲，平均(38.81±7.91)歲，病程3～18 年，平均(6.12±5.51)年。兩組患者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年更新版)》[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)進行診斷。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

①納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選者均為已確定診斷的CHB 患者；血清HBsAg、HBeAg 均陽性，HBV-DNA 大于106至107copies/mL；未服用抗病毒類藥物及免疫調(diào)節(jié)的時間大于6 個月；經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，自愿簽署知情同意書，加入本治療方案。②排除標(biāo)準(zhǔn)：重疊其他肝炎病毒感染及肝硬化、肝癌者；合并惡性腫瘤者；嚴(yán)重的心腦血管疾病、嚴(yán)重精神障礙患者及糖尿病、酗酒、腎功能障礙者；妊娠期及哺乳期婦女。

1.4 治療方法

兩組患者均給予常規(guī)保肝及對癥治療。在此基礎(chǔ)上，觀察組患者給予替諾福韋 （TDF）（生產(chǎn)廠家：葛蘭素史克；進口注冊證號H20130589），口服，每天1 片，每次300mg，空腹服用，同時給予胸腺肽腸溶片（生產(chǎn)廠家：黑龍江喜人藥業(yè)集團有限公司；國藥準(zhǔn)字H20063310）口服，每天3 次，每次10mg。對照組患者給予替諾福韋口服，每天1 片，每次300mg，空腹服用。

1.5 觀察指標(biāo)

①采用全自動分析儀（7080 型，日立HITACHI 公司），試劑由寧波美康生物科技有限公司提供，檢測肝功能指標(biāo)：血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、總膽紅素(TBil)；②HBV 標(biāo)記物：HBeAg 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，HBV-DNA 定量采用熒光定量PCR 法檢測，采用ABI PRISM7300RT-PCR 檢 測 儀（美 國）進 行 定 量 檢 測（試 劑：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；③T 淋巴細(xì)胞亞群檢測：采用流式細(xì)胞儀（艾森生物有限公司）檢測患者外周血CD45+、CD45+CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+等細(xì)胞絕對計數(shù)和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值；④血清miR-122、miR-21 檢測：PCR 熱循環(huán)儀為德國Eppendorf 公司、實時熒光定量測定PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司，特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物由生工生物工程（上海）有限公司提供，RNA 提取試劑盒及熒光定量PCR 檢測試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。用RT-PCR 法檢測血清miR-122、miR-21 的表達(dá)，采用U6 作為內(nèi)參照PCR 的相對測定方法，均以2-△△Ct法計算miR-122、miR-21 相對表達(dá)量，ΔΔCt ＝待測樣本的ΔCt-對照樣本ΔCt，ΔCt ＝目的基因Ct 值-內(nèi)參基因Ct 值。Ct 值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad Prism8.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪制圖形，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t 檢驗,計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療后肝功能指標(biāo)變化情況

觀察組治療后ALT、AST、GGT、TBil 較對照組明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05)；觀察組治療后HBeAg 陰轉(zhuǎn)率和HBVDNA 應(yīng)答率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05)。詳見表1。

表1 觀察組和對照組CHB 感染者治療后肝功能和免疫學(xué)指標(biāo)情況(n=48,

表1 觀察組和對照組CHB 感染者治療后肝功能和免疫學(xué)指標(biāo)情況(n=48,

組別 ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) TBiL(umol/L) HBeAg 轉(zhuǎn)陰率(%) HBV-DNA 轉(zhuǎn)陰率(%)觀察組 34.8±22.4 43.5±18.6 68.5±31.3 27.3±13.2 20（41.67） 39（81.25）對照組 51.9±21.7 60.3±23.1 89.3±43.6 46.8±19.2 11（22.92） 25（52.08）t 值/χ2 值 3.7987 3.9246 2.6850 5.7983 3.8589 9.1876 P 值 0.0003 0.0002 0.0086 0.0000 0.0495 0.0024

2.2 兩組患者治療后免疫功能指標(biāo)變化情況

觀察組治療后CD45+,CD45+CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+細(xì)胞絕對計數(shù)明顯較對照組改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.2443，P=0.0 0 0 1；t=7.3 1 4 8，P=0.0 0 0 0；t=3.6 2 2 2，P=0.0 0 0 5；t=3.4420，P=0.0009，P 均＜0.05)，觀 察 組 治 療 后CD3+CD4+/CD3+CD8+(1.83±1.05)較對照組(1.21±0.95)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.0336，P=0.0031＜0.05)，詳見圖1。

圖1 觀察組與對照組治療后的T 細(xì)胞亞群絕對計數(shù)分布

2.3 兩組患者治療后血清中miR-122、miR-21 表達(dá)水平的變化情況

觀察組治療后，血清中miR-122、miR-21 表達(dá)水平較對照組明顯下降，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.3878，P=0.0189； t=2.9198，P=0.0044。P 均＜0.05)，詳見圖2。

圖2 觀察組與對照組治療前后的miR-122、miR-21 表達(dá)情況

3 討論

慢性乙型肝炎是我國臨床上常見的、高發(fā)的傳染病，目前研究認(rèn)為其發(fā)病機制主要是持續(xù)復(fù)制的高病毒載量和免疫介導(dǎo)的非特異性免疫應(yīng)答損傷[4-5]及特異性T 淋巴細(xì)胞功能耗竭、凋亡[6]所致的肝細(xì)胞損傷及炎癥發(fā)生。因此，在抑制CHB 復(fù)制的同時調(diào)節(jié)免疫是較理想的治療方法。替諾福韋為一種單磷酸腺苷類似物，經(jīng)水解、磷酸化產(chǎn)生替諾福韋二磷酸，參與病毒DNA 整合，阻礙病毒DNA 延長，從而抑制HBV 復(fù)制[7]。據(jù)研究資料顯示，替諾福韋能快速、有效控制乙肝病毒，無論是在HBV-DNA 的陰轉(zhuǎn)、HBeAg轉(zhuǎn)換方面，還是在安全性、耐藥性方面均優(yōu)于其它核苷（酸）類似藥物，并且還能有效延緩肝硬化進展及降低肝癌的發(fā)生率，改善病情，提高生活質(zhì)量，為慢性乙型肝炎的首選藥物[8-9]。胸腺肽能調(diào)節(jié)免疫，促進T 淋巴細(xì)胞成熟，誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞亞群發(fā)育和成熟，增強巨噬細(xì)胞吞噬能力，提高白介素n 產(chǎn)生水平與受體表達(dá)水平，增加CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量[10-11]，從而調(diào)節(jié)和增強機體的細(xì)胞免疫功能，增強機體抵抗力，二者聯(lián)合應(yīng)用治療CHB 患者可提高療效。本研究對96 例CHB 患者在替諾福韋治療基礎(chǔ)上給予胸腺肽治療，并以單獨采用替諾福韋治療進行對照，結(jié)果顯示：治療后觀察組肝功能指標(biāo)（ALT、AST、GGT、Tbil）、BeAg陰轉(zhuǎn)率、HBV-DNA 水平及免疫功能指標(biāo)(CD45+、CD45+CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+)與對照組比較顯著改善(P＜0.05)。表明替諾福韋聯(lián)合胸腺肽治療能提高CHB 患者的臨床效果。

miRNA 是一類內(nèi)源性長度由20～25 個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，能夠調(diào)節(jié)mRNA 的表達(dá)[12]。在慢性HBV 感染者中，miR-122、miR-21 血清含量的表達(dá)，可作為肝組織損傷的標(biāo)志物，具有良好的敏感性和特異性[13-14]。并有研究發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-21 高表達(dá)及其表達(dá)水平與肝硬化及HCC 患者的臨床分期、分化程度密切相關(guān)[15]。這說明miR-122、miR-21 的表達(dá)在乙肝病毒的復(fù)制、肝細(xì)胞的損傷和疾病的進展中可能起著重要作用。研究結(jié)果顯示治療后, 觀察組miR-122、miR-21 的表達(dá)水平顯著下降 ,與治療前和對照組均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P＜0.05)。提示替諾福韋聯(lián)合胸腺肽治療可以降低CHB 患者血清中miR-122、miR-21的表達(dá)水平，從而減輕肝臟的炎癥損傷，降低肝癌的發(fā)生率，并有助于疾病進展的評估與風(fēng)險預(yù)測。

綜上所述，替諾福韋聯(lián)合胸腺肽治療CHB 患者能有效促進肝功能恢復(fù),抑制HBV-DNA 復(fù)制，提高HBeAg 陰轉(zhuǎn)率，增強機體免疫力，降低血清中miR-122、miR-21 的表達(dá)水平，改善肝臟炎癥損傷及降低肝癌的發(fā)生率，尤其是在以HBV 基因型C 基因型為主的唐山地區(qū)[16]具有積極的臨床意義。