應用生物信息學方法篩選食管鱗癌的關鍵基因

趙飛 原志慶

[摘要] 目的 篩選食管鱗癌的關鍵基因，為腫瘤的發病機制研究提供新的思路。 方法 檢索GEO數據庫中食管鱗癌基因表達芯片，分析差異表達基因并獲得共同差異基因;利用在線數據庫DAVID進行GO和KEGG通路富集分析;通過String數據庫和Cytoscape軟件分析獲取鏈接度最高的10個關鍵基因，并在TCGA數據庫中驗證。結果 共篩選出204個差異表達基因。GO分析顯示其生物學過程富集在細胞分裂、細胞器斷裂和細胞周期等163個條目中;細胞學組分富集在細胞外、細胞質和細胞器腔內等48個條目中;分子功能富集在調控肽酶活性、與細胞外基質結合等46個條目中。KEGG通路富集在局部黏附、p53信號通路、錯配修復等12個條目中。篩選出10個鏈接度最高的Hub基因，且通過TCGA數據庫驗證其全部在食管鱗癌組織中高表達（P < 0.01）。 結論 CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1是食管鱗癌的關鍵基因，可能是食管鱗癌的生物標志和治療靶點。

[關鍵詞] 食管鱗癌;關鍵基因;生物信息學;基因芯片

[中圖分類號] R735.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0009-05

The key genes in esophageal squamous cell carcinoma screened by bioinformatics

ZHAO Fei1 ? YUAN Zhiqing2

1.The Third Clinical College， Xinxiang Medical University， He′nan Province， Xinxiang ? 453003， China; 2.College of Basic Medicine， Xinxiang Medical University， He′nan Province， Xinxiang ? 453003， China

[Abstract] Objective To provide new ideas for the study of tumor pathogenesis by screening the key genes of esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）. Methods The gene expression chips of ESCC were retrieved in GEO database. The differential expression genes were analyzed for obtaining common differential genes. GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed in DAVID online database. The 10 key genes with the highest link were obtained by String database and Cytoscape software， and verified in the TCGA database. Results A total of 204 differentially expressed genes were screened. GO analysis showed that the biological process was enriched in 163 items， such as cell division， organelle fission， cell cycle， etc. Cytological components were enriched in 48 entries including extracellular， cytoplasmic and organelle lumen. Molecular function enrichment in 46 entries， such as regulating peptidase activity， binding to extracellular matrix， etc. KEGG pathways were enriched in 12 entries， including local adhesion， p53 signaling pathways， mismatch repair， etc. The 10 highest-linked Hub genes were verified to be highly expressed in ESCC by TCGA databases （P < 0.01）. Conclusion CDK1， CCNA2， RFC4， CCNB1， TOP2A， AURKA， CDC6， BUB1， BUB1B and PLK1 are the key genes of ESSC， and may be biomarkers and therapeutic targets in ESCC.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; Key genes; Bioinformatics; Gene chip

根據WHO統計，全世界每年約有40萬人死于食管癌，其中我國約20萬人，占世界的一半[1]。食管癌主要有兩個亞型——食管鱗癌和腺癌，我國食管癌患者主要為鱗癌。目前食管癌的發生發展及轉移機制尚不清楚，因此進一步研究其發病機制，建立有效的預防和診療方法，是迫切需要解決的問題。本研究通過分析GEO數據庫[2]中食管鱗癌的相關芯片數據，旨在挖掘食管鱗癌的關鍵基因，利用生物信息學方法探討其可能的發病機制，為進一步的基礎與臨床研究提供方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

資料來源GEO在線數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），下載食管鱗癌全基因組表達譜芯片數據集。入選條件：①全基因組RNA表達譜芯片;②人食管鱗癌組織與配對的癌旁正常組織。

1.2 方法

1.2.1 分析差異表達基因 ?①數據預處理：將下載的芯片數據導入R語言，經RMA法進行背景校正和矩陣數據歸一化處理獲得標準化芯片表達矩陣數據;②篩選差異表達基因：使用“Limma”包[3]篩選差異倍數（FC）>2且P < 0.01的數據作為有意義的差異表達基因，并使用“ggplot”包繪制火山圖。

1.2.2 共同差異表達基因 ?將篩選出的各個基因芯片數據集的差異表達基因取交集，獲得共同的差異表達基因。

1.2.3 GO與KEGG通路富集分析 ?將共同差異表達基因導入DAVID 6.8分析工具（http：//david-d.ncifcrf.gov）[4]，進行GO與KEGG通路富集分析[5]，條件設定為P < 0.01，結果使用“ggplot 2”包[6]繪制氣泡圖。

1.2.4 PPI網絡構建與關鍵基因分析 ?將篩選出的共同差異表達基因通過數據庫String 11.0（http：//www.string-db.org）進行蛋白互作PPI網絡分析，結果導入Cytoscape軟件的CytoHubba插件[7]，獲取鏈接度最高的10個Hub基因。

1.2.5 關鍵基因驗證 ?通過GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）[8]網站，驗證這10個Hub基因在TCGA和GTEx[9]數據庫的表達情況，確定食管鱗癌的關鍵基因。

2 結果

2.1 食管鱗癌芯片數據集篩選

通過GEO數據庫共篩選出符合條件的數據集三組，分別為GSE23400[10]、GSE20347[11]和GSE17351[12]，樣本均為食管鱗癌及其配對癌旁正常食管黏膜組織。見表1。

表1 ? 食管鱗癌基因表達譜芯片數據集基本信息

2.2 差異表達基因分析

分析各組芯片數據集差異倍數FC > 2且P < 0.01的差異表達基因。見表2、圖1。

表2 ? 食管鱗癌基因表達譜芯片數據集DEGs分析結果（個）

2.3 共同差異表達基因

對三組數據集差異表達基因進行Venn交集[13]，共獲得204個共同差異表達基因，其中上調的167個，下調的37個。見圖2。

2.4 GO富集分析

將共同差異表達基因導入DAVID 6.8進行GO富集分析，發現食管鱗癌共同差異表達基因主要富集在細胞分裂、細胞周期、有絲分裂等163個生物過程中;主要位于細胞質、細胞器腔內、細胞核等48個細胞學組分中;主要參與調控肽酶活性，與細胞外基質、結構特異性DNA結合等46個分子功能。取統計學意義最為顯著（P值最小）的前15個。見圖3（封三）。

2.5 KEGG通路富集分析

共同的差異表達基因在KEGG通路方面主要富集在小細胞肺癌、癌癥通路、局部黏附、細胞周期、DNA復制等12個條目中（圖4，封三）。

2.6 Hub基因篩選

通過分析工具String 11.0對這些共同的差異基因構建PPI網絡，再利CytoHubba插件，對其互作關系進行MCC算法分析，得到鏈接度最高的10個Hub基因（圖5）。鏈接度由高至低分別為CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1。

2.7 關鍵基因在公共數據庫中的驗證

將篩選出的10個Hub基因通過GEPIA2網站驗證，顯示在TCGA和GTEx數據庫中，相對于食管癌旁正常組織，10個基因在食管癌組織中均呈高表達狀態（P < 0.01）（圖6），說明其是食管癌的關鍵差異基因。

3 討論

本研究分析GEO數據庫中3個食管鱗癌全基因表達譜芯片數據，發現相對于配對正常食管黏膜組織，共有204個差異基因為3個芯片數據集共有。對其進行GO功能注釋發現其與細胞周期、有絲分裂、細胞黏附等生物學過程相關。KEGG通路富集分析表明食管鱗癌與小細胞肺癌、膀胱癌可能具備相同的分子機制，提示其與細胞周期、局部黏附、p53信號通路等機制相關。

分析以上結果，發現GO與KEGG通路富集分析均提示細胞周期和細胞黏附可能與食管癌密切相關。細胞周期與惡性腫瘤發生關系密切，細胞周期調控紊亂可以導致細胞失控性增殖，這也是惡性腫瘤最基本的生物學特征[14]。p53信號通路參與細胞周期調控，誘導G1、G2期阻滯，這與腫瘤的發生、發展密切相關。細胞黏附在腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用，腫瘤細胞發生黏附特性的改變，使其易從原位細胞群中解黏附脫離出來，進入血液和淋巴循環系統，同時也使腫瘤細胞到達靶器官后，更容易與靶器官的基質黏附[15]。所以通過公共數據庫進行大數據挖掘與分析，為腫瘤發病機制的研究提供方向與思路是可行的。

通過構建PPI網絡，得到10個核心差異基因：CDK1、CCNA2、RFC4、CCNB1、TOP2A、AURKA、CDC6、BUB1、BUB1B、PLK1。10個基因中，除RFC4、BUB1、BUB1B基因未見報道外，其余均已有相關報道。CDK1在細胞周期中介導細胞從G2期進入M期，是參與細胞有絲分裂的主要因子[16]。CDK1也是食管癌及癌前病變的診斷、預后標志物和潛在治療靶點[17]。CCNA2與CCNB1與CDK激酶相互作用，參與細胞周期調控[18]。TOP2A在調節細胞周期和調節腫瘤增殖中起著重要作用，是各種腫瘤進展和預后的潛在生物標志物[19]。AURKA是細胞周期正常發生的必需蛋白，該基因的突變與多種類型癌癥發生有關，AURKA在乳腺癌、結腸直腸、前列腺癌等幾種細胞系中過表達[20]。本研究進一步驗證了這10個基因在TCGA數據庫中的表達情況，結果顯示其在食管癌樣本中全部高表達，表明它們可能是食管鱗癌的生物標志物。雖然本項研究是一種傾向性研究，最終需要大量實驗數據的證實，但也為食管癌的發病機制研究提供了基礎信息和新的研究方向。

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（收稿日期：2020-01-13 ?本文編輯：李亞聰）