建立大鼠動脈粥樣硬化模型的研究進展

王淑琪 李慧 楊曉強 白云綺 林繄依 高照 孫克寒 聶波

[摘要] 動脈粥樣硬化是受累動脈從內膜開始病變的一種常見血管病，是冠心病、腦梗死、外周血管病的主要發(fā)病原因，嚴重危害人類身體健康。建立動脈粥樣硬化動物模型對深入了解動脈粥樣硬化發(fā)病機制、發(fā)生發(fā)展過程、臨床診斷和防治都具有重大意義。通過查閱國內外相關文獻，本文歸納和總結大鼠動脈粥樣硬化建模方法，比較各種建模方法的優(yōu)缺點，概述建立動脈粥樣硬化動物模型的現(xiàn)狀與進展，總結發(fā)現(xiàn)單純高脂飼料喂養(yǎng)很難形成動脈粥樣硬化病變，而高脂飼料結合維生素D只能造成早期病變且造模時間較長，但高脂飼料結合維生素D的同時，加以手術機械損傷作用可形成與人類動脈粥樣硬化相似的較成熟的病變斑塊。

[關鍵詞] 大鼠;動脈粥樣硬化;動物模型;研究進展

[中圖分類號] R-332 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）04（c）-0045-05

Progress in the establishment of atherosclerosis models in rats

WANG Shuqi1，2 ? LI Hui1，2 ? YANG Xiaoqiang3 ? BAI Yunqi2 ? LIN Yiyi2 ? GAO Zhao2 ? SUN Kehan1 ? NIE Bo1，2▲

1.School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100029， China; 2.Key Laboratory of Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine of Ministry of Education， Beijing Key Laboratory， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing ? 100700， China; 3.Department of Stomatology ， Army Equipment Department Clinic， Beijing ? 100012， China

[Abstract] Atherosclerosis is a common vascular disease that affects the arteries from the intima， and it is the main cause of coronary heart disease， cerebral infarction and peripheral vascular disease. The establishment of an animal model of atherosclerosis is of great significance in understanding the pathogenesis， development， clinical diagnosis and prevention of atherosclerosis. By referring to relevant literatures at home and abroad， this paper summarizes the modeling methods of atherosclerosis in rats， compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， and summarizes the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis. Through the review of related literature at home and abroad， this article induces and summarizes the modeling method of atherosclerosis in rats， and compares the advantages and disadvantages of various modeling methods， an overview of the current situation and progress of establishing animal models of atherosclerosis， and concludes that the simple high-fat feed is difficult to form the atherosclerosis lesions， and high-fat feed combined with vitamin D can cause early pathological changes and the build mode for a long time， but the high fat feedstuff combined with vitamin D at the same time， the mechanical damage to surgery can form and human similar mature lesions of atherosclerosis plaques.

[Key words] Rat; Atherosclerosis; Animal models; Research progress

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種慢性炎癥性疾病，是由多種因素共同作用引起的，發(fā)病機制復雜[1]。構建AS動物模型對于探究AS的病因、發(fā)病機制、防治和藥物研發(fā)具有重要意義[2]。目前有關AS的發(fā)病機制的假說有：脂質浸潤學說、鈣超載學說、內膜損傷學說、免疫反應學說等。雖然這些假說都從某一方面解釋了AS的發(fā)病機制，但這些假說并不能全面的闡述AS的發(fā)生、發(fā)展過程與機理。在AS的發(fā)展過程中，大量脂質在血管中積累，鈣質也在血管沉積從而導致血管鈣化、血管內皮損傷，此變化加劇了脂質的侵入和損傷，同時又有炎性因子引起的免疫反應，多種因素共同作用導致AS[3]。因此，為了深入探究AS的發(fā)病機制，構建一個合適的AS動物模型是非常重要的。

動物模型對于假設驗證和臨床實驗研究是必不可少的，但也存在發(fā)病機制不同、病理進程難以控制、操作受限等缺點[4]。目前，AS未有完美的動物模型，常用于研究該疾病的實驗動物有：豬、猴、家兔、鵪鶉、大鼠和小鼠等。鼠類因其體型小、生存能力強、繁殖迅速、獲取容易等優(yōu)勢一直被作為臨床試驗中應用范圍最廣、應用數量最多的實驗動物，尤其是ApoE-/-等轉基因小鼠被廣泛用于復制AS模型，其優(yōu)點為能自發(fā)AS，普食喂養(yǎng)便可形成嚴重的高脂血癥，高脂飲食喂養(yǎng)可加速斑塊的形成，且其斑塊的分布與人類AS的分布極為相似，但由于體型小、可獲得的血液樣本少等缺點無法進行類似多指標血液檢測等的實驗研究。由于大鼠具有應用范圍廣泛、體型較大、獲取容易、飼養(yǎng)方便、死亡率低、能夠獲取足夠的血液及其組織標本等特點，越來越多研究學者更傾向于用大鼠來建立AS模型，故本文對建立大鼠AS模型方法的研究進展做一綜述。

1 單純高脂飼料建立AS模型

AS發(fā)病因素多樣，其中膽固醇沉積是發(fā)生AS的初始過程，脂類是AS形成的物質基礎前提條件，其能沉積于血管內膜，從而形成粥樣斑塊。脂類包括膽固醇及其酯、三酰甘油等物質，脂質代謝紊亂在AS的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，是導致AS的根本原因。大部分AS模型的建立都是基于大量的脂質再結合其他方法共同構建模型，血漿膽固醇水平與AS的產生呈正相關[5]。因此，建模時的高脂飼料配方多以高比例的膽固醇、豬油等作為脂質來源。高脂飼料配方多由1%～3%膽固醇、8%～10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、81.3%～85.3%普通飼料組成。大量學者研究表明[6-8]，在高脂飼料中添加抑制甲狀腺功能的丙基硫氧嘧啶可以引起動物高脂血癥的形成和早期粥樣硬化病變，且此類藥物可以一定程度地降低膽固醇代謝，盡量多地保存動物體內的膽固醇含量;添加膽酸鈉可提高脂肪和膽固醇的吸收程度，提高大鼠體內膽固醇含量;加入豬油的目的也是為了提高脂肪含量，并且豬油的黏合度較高可使飼料更好成形，幫助大鼠更好的咀嚼，刺激飲食欲;白糖可以一定程度地轉化成脂肪積累，還可以改善丙基硫氧嘧啶和膽酸鈉帶來的高脂飼料過苦的味道，增強大鼠食欲。

添加丙基硫氧嘧啶的高脂飼料容易導致大鼠食欲減退、食量減少甚至體重下降等現(xiàn)象，給予丙基硫氧嘧啶的方式有直接添加進飼料中、灌胃等，可按不同造模需求進行選擇，但劑量的選擇則會因不同的喂養(yǎng)方式有一定的差別。純高脂飼料喂養(yǎng)法構建AS模型的方法優(yōu)點是操作相對簡單，成本也比較低廉，但缺點就是動物成模率較低，且造模周期也較長，無法形成穩(wěn)定的AS斑塊[9]。因此大多數實驗研究更傾向于在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎上聯(lián)合應用其他損傷操作，達到構建模型更好更快的目的。

2 高脂飼料聯(lián)合維生素D建立AS模型

由于大鼠無膽囊的生理結構特點，造成大鼠對膽固醇等脂質吸收較少，單純的高脂飼料喂養(yǎng)只能造成大鼠體內脂質沉積，難以造成與人類相似的AS斑塊產生與病變，因此高脂飼料結合一些可以導致或加速AS形成的藥物共同作用于大鼠，可有效的提高模型復制效率。大量學者研究發(fā)現(xiàn)，人類AS患者的血管壁中含有大量的鈣物質，其含量與冠心病的病變程度呈正相關[10]。維生素D3作為鈣離子誘導劑，可促進血鈣吸收，損傷動脈血管壁內皮，破壞其完整性，有利于脂質侵入并加重血管壁損傷，再結合鈣鹽沉積，使平滑肌細胞變性，從而加速動脈病變形成斑塊[11]。Yang等[12]采用含1%膽固醇高脂飼料聯(lián)合維生素D3（700 000 U/kg）的制備方法于飼養(yǎng)6周后成功建立穩(wěn)定、可重復的AS模型。Song等[13]以高脂飼料為誘導聯(lián)合腹腔注射維生素D3注射液，6周后成功復制AS大鼠模型。AS模型大鼠的主動脈內皮細胞增殖，泡沫細胞堆積，主動脈內膜介質明顯厚于正常組的主動脈內膜，與正常組大鼠的AS病變比較，AS模型組病變明顯增加。

通常高脂飼料結合維生素D3來建立AS模型，但也有不少研究采用維生素D2來代替維生素D3復制AS模型。董兆旻等[14]利用高脂飲食和1次維生素D2注射成功建立了SD大鼠模型。維生素D3與維生素D2沒有太大的區(qū)別，兩者之間的區(qū)別在于化學結構不同，維生素D2為麥角骨化醇，維生素D3為膽骨化醇，而對于體內的代謝與作用機制完全相同，通過肝臟和腎臟的羥化作用，最終代謝產物是一樣的，文獻中均有使用[15]。

使用維生素D配合制備AS模型的方法有多種，常用腹腔注射法、灌胃或直接大劑量添加到飼料中，可根據不同的實驗需求和目的自行選擇。關于維生素D給藥劑量和給藥時間經查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，各研究者的結論不盡相同，缺乏統(tǒng)一的認識與規(guī)范。Hu等[16]在制備AS模型開始時，將每只大鼠腹腔注射維生素D3 700 000 U/kg，分3次給藥，1次/d，以此復制大鼠AS模型。周紅等[17]在制備大鼠AS模型前每只大鼠腹腔注射600 000 U/kg，造模后第3、6、9周各腹腔注射100 000 U/kg的維生素D3是比較有效的構建AS大鼠模型的方法，具有成模率高、死亡率低等優(yōu)點，且發(fā)現(xiàn)用高脂飼料聯(lián)合維生素D3制備AS大鼠模型時，維生素D3劑量過小，很難造成典型的AS血管病變;而劑量過大更易誘導出AS病變，但會導致大鼠體重下降明顯，飲食量降低，造成高達40%的死亡率。

高脂飼料喂養(yǎng)結合維生素D2/D3復制模型的實驗方法優(yōu)點是實驗操作比較簡單，大鼠的整個AS發(fā)生發(fā)展過程比較穩(wěn)定，這種方法比較好地彌補了AS病變過程中里只有膽固醇沉積而缺少鈣沉積的缺點，是一種比較有效且常見的AS模型復制方法[18]。此方法發(fā)生的主要病理變化為血管壁鈣質沉積，內膜損傷，中膜纖維細胞明顯增生，并形成纖化灶，內膜下層有泡沫細胞浸潤，主要體現(xiàn)出AS早期的病理狀態(tài)，無法快速形成成熟的粥樣斑，但動脈鈣質沉積且鈣化對于評估和預測心肌梗死、腦卒中或死亡以及積極預防和治療心腦血管疾病亦具有重要的臨床意義[19]。

采用此方法制備AS模型時對于維生素D的給藥劑量及給藥周期要求比較嚴格，給藥劑量太高或者過低都不利于模型的成功復制。劑量過高會導致大鼠厭食嚴重、體型消瘦、體重減輕甚至死亡，過低又不易形成AS典型病理狀態(tài)，因此，在造模過程中應密切觀察動物的精神狀態(tài)、飲食情況和體重變化，結合自身的實驗需求進行復制模型，但此造模方式耗時較長，要保持足夠的耐心。

3 高脂飼料聯(lián)合免疫炎癥建立AS模型

1999年，Ross[20]提出AS是一種炎癥性疾病，炎性細胞通過吞噬作用清除脂質物質，同時形成泡沫細胞，并形成脂質沉積核心，引起AS斑塊的形成[21]。此外，可能與其他炎性因子相互作用促進AS的發(fā)生。隨著研究的不斷深入，AS中新的細胞因子不斷檢出，炎性因子已成為AS病變過程中的重要因素[22]。周麗程等[23]利用大鼠腹腔注射維生素D3和卵清白蛋白致敏，造成大鼠免疫炎癥，高脂飼料喂養(yǎng)14周后大鼠主動脈出現(xiàn)AS斑塊。

從免疫學角度建立AS模型是可行的，遵從AS的形成是多種機制共同作用的結果，但此方法尚在起步階段，許多方面不成熟，且此方法難免會對動物產生免疫損傷等不良反應。

4 機械損傷法建立AS模型

雖然以上3種方法在操作性和可行性上都能成功的復制AS模型，但不足的是實驗周期過長，為了彌補這一缺點，研究學者們在高脂飼料喂養(yǎng)下聯(lián)合手術的直接損傷作用于大鼠可加速AS的病變進程。主要的手術應用有以下幾種：

4.1 球囊損傷術

球囊損傷術是制備血管損傷后再狹窄模型的常見方法，此方法的主要操作是將一定直徑大小的球囊放入動脈血管后充盈球囊，通過反復拖拉充盈后的球囊造成動脈血管內皮細胞損傷，造成內皮細胞的即刻脫落，彈力板及中膜嚴重損傷，引起局部血管狹窄。Yin等[24]以高脂飼料喂養(yǎng)為基礎聯(lián)合腹腔注射維生素D3和球囊損傷手術于飼養(yǎng)大鼠8周后成功復制AS模型，手術組大鼠較假手術組大鼠有明顯的AS斑塊形成。蔡宏文等[25]將高脂飼料喂養(yǎng)、維生素D3腹腔注射和球囊損傷術聯(lián)合應用建立大鼠AS模型，給予大鼠1次性腹腔注射維生素D3 400 000 U/Kg，高脂喂養(yǎng)7 d后進行球囊手術，6周后造模成功。

進行球囊損傷手術時需要注意選擇內徑大小適宜的球囊，牽拉過程中速度、力度的把握以及對球囊擴張壓力的控制。球囊擴張?zhí)^、來回牽拉太快或操作人員用力過大都會容易造成動脈的破裂，過度損傷;反之擴張不夠、牽拉過于緩慢又不能造成有效的內膜損傷，所以建立成功的AS模型[26]，球囊損傷術對操作人員技術要求比較高。在球囊損傷手術之后的3～5 d需密切觀察動物狀態(tài)，還需腹腔注射青霉素鈉防止術后感染，造成不必要的死亡與損傷。

4.2 電擊損傷術

此方法原理為通過一定的電擊刺激可引起血管內膜損傷，激活血小板，血小板聚集后會釋放出一些活性物質，這些物質則會促進內皮細胞損傷，使其損傷加重，隨著時間的延長，可形成明顯的AS斑塊。尚曉玲等[27]利用高脂飼料及頸動脈電擊損傷聯(lián)合作用制備AS模型，通過對影響因素的多次實驗篩查，最終大鼠高脂飲食聯(lián)合腹腔注射維生素D2加頸動脈電擊損傷（1 mA、5 min）復合因素所致的AS模型建立成功。

此手術方法對于電流強度與電擊時間要求比較嚴格，電流強度過大時容易造成動脈血管壁出現(xiàn)比較明顯的焦灼痕且容易導致動脈穿孔，電擊造成的損傷嚴重破壞動脈血管壁結構，導致大鼠死亡率增高，這也是大多數研究者不常采用此方法的原因之一;電流強度過小時即使增加電擊時間也不易引起血管壁損傷，形成AS病變。

4.3 動脈鉗夾術

手術動脈鉗夾法的原理是機械壓迫阻斷動脈正常供血，導致局部血管缺血缺氧，頸動脈內膜損傷，引發(fā)炎性反應，進而促進AS的發(fā)生。王慶林等[28]使用血管鉗夾住大鼠一側頸動脈20 min，手術后以高脂飲食喂養(yǎng)，6周時大鼠動脈內膜便有明顯增厚，大量泡沫細胞聚集的現(xiàn)象，10周時形成典型纖維帽，成功建立大鼠AS模型。

此方法建立AS大鼠模型的優(yōu)點在于能夠人為控制AS的形成或病變部位，比較有利于對AS的并發(fā)癥腦卒中的研究[29]，但此種造模方法的缺點是對實驗人員的操作技術要求較高，且手術中的不穩(wěn)定因素較多，在大鼠造模中的個體差異較大，不易形成穩(wěn)定的AS病變和統(tǒng)一的AS模型。

5 結語

AS是常見的心血管疾病，建立不同階段的人類AS病理變化和發(fā)病過程的理想動物模型對于提高心血管疾病的防治尤為重要。

從AS的發(fā)病機制出發(fā)，脂類沉積、血管鈣化、炎癥、免疫機制或機械損傷引起內膜受損是建立大鼠AS模型的前提，各種構建AS動物模型的方法在模型形成時間、動脈硬化程度及病變發(fā)展上都有所不同，應根據研究目的來選擇。

從AS的病理變化狀態(tài)出發(fā)，當機體內血脂異常升高時，升高的脂質會聚集于動脈壁，形成肉眼可見的脂質條紋，進而演化為纖維斑塊，最后生成黃色粥樣斑塊，這是AS典型的病理變化[30]。就以上所述的幾種建模方法而言，純高脂飼料喂養(yǎng)很難導致AS病變，且造模周期較長;高脂飼料結合維生素D誘導只是導致大鼠形成AS早期的病理狀態(tài)，并沒有形成成熟的與人類病變相似的AS斑塊;大鼠高脂飼料喂養(yǎng)及維生素D損傷的同時，結合手術機械損傷作用可形成與人類AS相似的較成熟的AS斑塊。隨著研究學者們對AS的不斷深入了解與探究，相信一定會有一種比較完美的規(guī)范的與人類病理狀態(tài)相似的大鼠AS模型。

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（收稿日期：2019-09-09 ?本文編輯：顧家毓）