血清miR-223、CXCR4與冠狀動脈支架內再狹窄的關系探討

隨著醫療技術快速發展，經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)已成為冠心病治療的重要手段，臨床應用率達90%以上，顯著降低冠心病血管事件的發生率和死亡率[1]。血管管腔內介入治療創傷小，已成為冠心病病人首選的治療術式，同時支架植入后并發癥逐漸受到臨床關注。約10%的病人PCI術后數月內發生支架內再狹窄(in-stent restenosis，ISR)，是PCI術療效不佳的主要原因，嚴重影響病人的生存質量和預后[2]。引起PCI術后ISR的發生與多個因素有關[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤增殖、免疫調控、炎癥反應和血管內膜再生等方面發揮重要作用[4]。miRNA功能復雜，目前研究尚不深入。趨化因子是一類能使細胞發生趨化運動的小分子細胞因子。CXC族趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)屬于CXC類趨化因子受體，是趨化因子基質細胞衍生因子-1(stromal cell-drived factor-1，SDF-1)受體，二者共同影響細胞遷移、組織的靶向作用[5]，但miR-223和CXCR4的表達與冠狀動脈支架內再狹窄的關系尚不清楚。本研究擬通過檢測血清miR-233、CXCR4在有無再狹窄冠心病病人中的表達情況，旨在探討二者與PCI術后冠狀動脈支架內再狹窄發生的關系。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

1.1.1 納入標準 符合2012年美國心臟學會制定的冠心病診斷標準[6]，并經冠狀動脈造影顯示冠狀動脈狹窄75%以上，進行支架植入手術；病人和家屬知情并自愿簽署知情同意書；病人依從性好，能配合完成治療和后期隨訪。

1.1.2 排除標準 心力衰竭及重度貧血病人；惡性腫瘤病人；血液系統、肝膽疾病、腎功能不全和急性感染病人；合并其他心臟疾病，如風濕性心臟病等。

1.2 臨床資料 選取2015年3月—2017年5月我院收治的冠心病病人210例為研究對象，擇期進行冠狀動脈造影檢查證實右冠狀動脈、左前降支和左回旋支中至少一支狹窄75%以上，適時進行支架植入手術治療。術后給予常規藥物治療。術后12個月內復查冠狀動脈造影，根據造影結果分為無再狹窄組(186例)和ISR組(24例)。無再狹窄組，男92例，女94例，年齡(68.95±12.42)歲；ISR組，男13例，女11例，年齡(70.13±18.64)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 分別收集兩組性別、年齡、體質指數(body mass index，BMI)、吸煙史，是否患有高血糖及藥物治療情況，是否患有高血壓性心臟病及藥物治療情況。松下EW-BU08J測量兩組收縮壓和舒張壓，抽取清晨空腹靜脈血，使用普朗XFA6100全自動血液細胞分析儀，檢測血液總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.3.2 冠狀動脈造影 采用德國西門子數字血管造影機(Axiom Artis FA)引導病人選取最佳體位，按照常規標準技術進行造影，選擇左冠狀動脈、右冠狀動脈左主干回旋支和左前降支，確定冠心病狹窄度及植入支架內是否存在再狹窄。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測血清miR-223和CXCR4表達水平 兩組均在冠狀動脈造影前抽取靜脈血5 mL于抗凝管，離心后取血清備用。以德國QiaGen總RNA試劑盒提取血清總RNA，按說明書進行操作。分別采用TaKaRa生產的miRNA反轉錄試劑盒和qRT-PCR反轉錄試劑盒，按照操作說明將2 μg無雜質完整RNA反轉錄為cDNA。按照TaKaRa公司SYBR Green PCR master mix試劑說明加配反應體系。qRT-PCR反應總體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進行反應，程序設定為：95 ℃預變性30 s，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，共40個循環，72 ℃終延伸10 min。其中miR-223以U6為內參基因，CXCR4以GAPDH為內參基因，引物見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt計算miR-223和CXCR4相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表2)

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血清miR-223和CXCR4表達水平比較 ISR組血清miR-223和CXCR4表達水平均高于無再狹窄組(P<0.05)。詳見表3。

2.3 miR-223和CXCR4水平與ISR病人臨床病理特征的關系 血清miR-223和CXCR4表達與ISR病人病變部位關系不明顯(P>0.05)；血清miR-223和CXCR4表達與ISR病人病變類型和長度有關(P<0.05)。詳見表4。

組別例數miR-223/U6CXCR4/GAPDH無再狹窄組1861.02±0.181.15±0.51ISR組242.87±0.723.87±0.69 t值-29.062-23.533 P 0.000 0.000

表4 ISR病人血清miR-223和CXCR4水平與臨床病理特征的關系

2.4 血清miR-223、CXCR4表達與ISR發生因素的相關性分析 Pearson相關性分析結果表明，血清miR-223、CXCR4水平與ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相關(P<0.05)；與ISR病人血清TG、HDL-C和HbA1c水平相關性不明顯。詳見表5。

2.5 影響冠狀動脈ISR發生的危險因素分析 Logistic分析結果顯示，血清miR-223、CXCR4、TC、LDL-C水平及高血壓、高血糖為冠狀動脈ISR發生的危險因素。詳見表6。

表6 影響冠狀動脈ISR發生的危險因素分析

3 討 論

冠心病是全球范圍內發病率和死亡率較高的心血管疾病之一，且呈增長趨勢[7]。PCI是臨床治療冠心病的主要手段，隨著接受PCI治療的冠心病病人逐年增加，支架植入后并發癥逐漸引起研究者廣泛關注。ISR定義為冠狀動脈造影發現支架內全程及支架近端、遠端5 mm范圍內管腔狹窄程度50%，是PCI術后諸多并發癥中常見的一種，嚴重影響手術治療效果和病人生存質量[8]。ISR發生的實質是血管對損傷的一種病理反應。與冠狀動脈粥樣硬化慢性進展不同，PCI是相對較短時間內發生復雜炎癥和修復過程，血管修復反應過度導致再狹窄。血管彈性收縮和血栓形成在冠狀動脈支架植入后數分鐘至數小時內完成，各種凝血因子及炎癥因子刺激平滑肌細胞增殖和細胞外基質形成，一般術后數月或數周內進行，平滑肌細胞增殖導致新生內膜增生是ISR發生的主要病理機制[9]。

冠狀動脈支ISR是一系列復雜的調控過程，受諸多因素影響。有研究表明，男性較女性更易發生ISR，高血糖和高血壓是影響ISR的常見原因，TC和LDL-C是冠心病的獨立影響因素并得到廣泛的重視[10]。本研究結果顯示，性別對冠狀動脈造影病人ISR的發生無明顯影響，可能是由于本研究樣本量有限造成；本研究結果發現，ISR組血壓、血糖、血清TC和LDL-C水平高于無再狹窄組，表明血壓、血糖和血脂影響ISR的發生，與李朝暉等[10]研究結果一致，進一步證實血糖、血壓和血脂影響冠狀動脈ISR的發生。

血管新生內膜增生是影響ISR發生的重要因素，趨化因子在血管內膜生成過程起關鍵作用。趨化因子是一類可驅使細胞定向遷移的細胞因子。根據氨基酸序列將其分為CXC類、CC類、CX3C類和C類4個亞類。SDF-1是CXC趨化因子家族成員，主要作用是驅使中性粒細胞、造血干細胞、內皮祖細胞和心肌干細胞等遷移，參與炎癥反應、血管新生、組織發育、腫瘤發生等生物過程[11]。CXCR4是SDF-1的特異受體，在造血功能、胚胎發育、腫瘤遷移中發揮重要作用[12]。本研究結果發現，ISR組血清CXCR4高表達病人ISR發生率高于低表達病人，推測CXCR4高表達可能通過參與新生內膜增生，影響冠心病病人PCI術后ISR發生。Shin等[13]研究表明缺血腦組織通過miR-223途徑，調控SDF-1和CXCR4表達，推測ISR病人血清CXCR4表達上調可能與miR-223調控有關。miRNA是一類小片段非編碼區RNA，主要通過特異結合靶基因3′-UTR，調控靶基因表達[14]。miRNA參與調控細胞生長、增殖、分化、炎癥和免疫反應等生命活動[15]。王芳等[16]研究發現miR-663、miR-126和miR-370在新生內膜增生相對表達發生差異性變化。有研究表明，miR-223在胃癌治療中發揮重要作用[17]，miR-223與ISR相關研究未見報道。本研究結果表明，ISR組血清miR-223水平高于無再狹窄組，表明miR-223表達水平升高可能與冠狀動脈ISR的發生有關。Pearson相關性分析表明，ISR的發生與血清miR-223水平、血清CXCR4水平呈相關。Shin等[13]在缺血腦組織研究表明miR-223調控SDF-1表達，SDF-1激活CXCR4受體表達。本研究推測ISR發生過程可能存在類似調

控機制，即miR-223高表達調控SDF-1，激活CXCR4高表達，促進冠心病病人PCI術后內膜增生反應。相關性分析結果表明，血清miR-223和CXCR4水平與ISR病人血清TC、LDL-C水平呈正相關。Logistic分析表明血清miR-223、CXCR4、高血糖、高血壓、TC和LDL-C水平為冠狀動脈ISR發生的危險因素，與以往研究結果[18]一致。推測miR-223可能通過調控SDF-1表達，激活CXCR4受體表達，影響冠心病病人PCI術后ISR的發生。

綜上所述，ISR病人血清miR-223和CXCR4表達水平增高，是影響ISR發生的危險因素，推測miR-223和CXCR4高表達與ISR的發生機制有關，本研究結果可為臨床預測ISR發生提供參考。