恒清方對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究

彭學(xué)豐李學(xué)敏曹健美李文濤

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是由于腦血管狹窄或閉塞，導(dǎo)致腦血流阻斷使腦組織發(fā)生缺血、缺氧，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)壞死軟化，引起腦功能障礙的一類(lèi)疾病，具有高發(fā)病率、致死致殘率、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，已嚴(yán)重威脅健康。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)是腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，腦功能未恢復(fù)，引起嚴(yán)重功能障礙，即缺血再灌注損傷，甚至腦水腫和腦出血。缺氧情況下星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，CIRI后腦組織內(nèi)滲入血液系統(tǒng)成分，引發(fā)血源性水腫，從而使得體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及血清白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等表達(dá)上調(diào)[1]。中藥恒清方是本課題組長(zhǎng)期用于治療缺血性腦血管病的臨床驗(yàn)方，療效顯著[2-5]。本研究探討恒清方對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 Molecular Devices Spectra MAX Plus 384酶標(biāo)儀(美國(guó)BD公司)；Millipore Simplicity純水儀(美國(guó)Millipore公司)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；TD24A-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。BCA蛋白定量測(cè)定、SOD(批號(hào)：20180405)、MDA(批號(hào)：20180406)、NO(批號(hào)：20180408)、IL-6(批號(hào)：20180302)、TNF(批號(hào)：20180414)、IL-1β(批號(hào)：20180315)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 恒清方組方：天麻30 g，鉤藤30 g，川芎15 g，丹參20 g，葛根20 g，地龍10 g。將上述中藥飲片浸泡30 min(蒸餾水)，用文火煎煮15 min，煎煮3次后，將煎煮藥液混合并過(guò)濾，過(guò)濾后分別濃縮為100%(低劑量)、200%(中劑量)、400%(高劑量)恒清方(生藥含量分別為1g/mL、2 g/mL、4 g/mL)，置于4 ℃冰箱中。所有中藥由上海市第六人民醫(yī)院中藥房提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0016，體質(zhì)量(250±20)g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于上海懿貝瑞生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將48只SD大鼠隨機(jī)分為6組：模型組(腦缺血再灌注組)、假手術(shù)組、恒清方低劑量組、恒清方中劑量組、恒清方高劑量組(恒清方分別為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)和尼莫地平組(尼莫地平20 mg/kg)，各8只。造模前1周開(kāi)始給藥，假手術(shù)組與模型組均給予等體積生理鹽水。

1.4.2 建立大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性栓塞(MCAO)模型[6-7]末次給藥30 min后，以Longa-Zea改良線栓法建立大鼠MCAO模型。具體方法：稱(chēng)重→10%水合氯醛(0.35 mL/kg)麻醉→固定→頸部正中切口→分離右側(cè)頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈→頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈近心端處結(jié)扎→頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉→頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處做一個(gè)“V”形切口→石蠟栓線從切口處插入→頸內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈夾開(kāi)啟→從分叉處將栓線推入頸內(nèi)動(dòng)脈→計(jì)算栓塞時(shí)間→結(jié)扎頸總動(dòng)脈上端→縫合→栓塞1.5 h后拉回線頭→栓線頭端退至頸外動(dòng)脈的切口處再灌注→24 h后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3 觀察指標(biāo)及方法

1.4.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 再灌注24 h后，觀察大鼠神經(jīng)功能癥狀，以Bederson方法[8]對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠行為學(xué)評(píng)分 單位：分

1.4.3.2 腦含水量、腦指數(shù)[9]大鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱(chēng)腦組織濕重(m1)并記錄，再放入恒溫干燥箱烘干至恒重，稱(chēng)其干重(m2)并記錄。腦含水量、腦指數(shù)計(jì)算公式：腦組織含水量=(m1-m2)/m1×100%；腦指數(shù)=m1/M×100%(M為大鼠體質(zhì)量)。

1.4.3.3 腦梗死面積[10]取腦組織(再灌注24 h后)→生理鹽水洗凈殘血→濾紙吸干→去除小腦、低位腦干→-20 ℃冰箱冷凍20min(均勻冠狀切片，共6片)→腦片浸入1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液→37 ℃暗處中孵育20 min(梗死面積呈白色，無(wú)梗死顯示紅色)→4%多聚甲醛溶液固定→6 h后取出腦片→濾紙吸去表面液體→相機(jī)拍照→Med Brain 2.0測(cè)定腦梗死面積。

1.4.3.4 NO、SOD、MDA水平 取腦組織(再灌注24h后)→生理鹽水沖洗干凈→濾紙吸干→稱(chēng)重→加入1∶9體積生理鹽水→10%腦勻漿液→檢測(cè)總蛋白(BCA法)、NO(硝酸還原酶法)、SOD(酶聯(lián)免疫法)、MDA(TBA法)。以上檢測(cè)均按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3.5 IL-6、IL-1β、TNF水平 再灌注24 h后→腹主動(dòng)脈處采血→離心15 min(4 ℃，3 500 r/min)→上清液保存于-20 ℃冰箱→450 nm下酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度→繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上操作按照IL-6、IL-1β、TNF試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分升高(P<0.01)；與模型組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方低劑量組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方中劑量組比較，恒清方高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)；恒清方高劑量組與尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 (±s) 單位：分

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01；與恒清方低劑量組比較，④P<0.05，⑤P<0.01；與恒清方中劑量組比較，⑥P<0.05；與尼莫地平組比較，⑦P<0.05。

2.2 各組大鼠腦含水量和腦指數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦指數(shù)、腦含水量均升高(P<0.01)；與模型組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組腦指數(shù)、腦含水量均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方低劑量組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組腦指數(shù)、腦含水量均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方中劑量組比較，恒清方高劑量組腦指數(shù)、腦含水量降低(P<0.05)；與尼莫地平組比較，恒清方高劑量組大鼠腦指數(shù)、腦含水量均降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

組別只數(shù)腦指數(shù) 腦含水量(%)假手術(shù)組80.58±0.03 82.05±0.41 模型組80.72±0.03① 85.15±0.67① 恒清方低劑量組80.70±0.04 84.59±0.87 恒清方中劑量組80.65±0.02②④ 83.60±0.45②④ 恒清方高劑量組80.61±0.01③⑤⑥⑦82.19±0.40③⑤⑥⑦尼莫地平組80.65±0.03②④ 83.68±0.54②④

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01；與恒清方低劑量組比較，④P<0.05，⑤P<0.01；與恒清方中劑量組比較，⑥P<0.05；與尼莫地平組比較，⑦P<0.05。

2.3 各組大鼠腦梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦梗死面積增加(P<0.01)；與模型組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組腦梗死面積降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方低劑量組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組腦梗死面積均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方中劑量組比較，恒清方高劑量組腦梗死面積降低(P<0.05)；恒清方高劑量組與尼莫地平組腦梗死面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位：%

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01；與恒清方低劑量組比較，④P<0.05，⑤P<0.01；與恒清方中劑量組比較，⑥P<0.05；與尼莫地平組比較，⑦P<0.05。

圖1 各組大鼠腦梗死面積圖像(TTC染色)

2.4 各組大鼠NO、SOD和MDA水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組SOD活性下降(P<0.01)，MDA和NO水平升高(P<0.01)；與模型組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組SOD活性升高(P<0.05或P<0.05或P<0.01)，MDA和NO水平降低(P<0.01)；與恒清方低劑量組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組SOD活性升高，MDA和NO水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與恒清方中劑量組比較，恒清方高劑量組SOD活性升高(P<0.05)，MDA和NO水平均降低(P<0.05)；與尼莫地平組比較，恒清方高劑量組SOD活性升高(P<0.05)，MDA和NO水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

組別只數(shù) SOD(U/mg)MDA(μmol/mg)NO(μmol/mg)假手術(shù)組8 35.03±2.67 4.83±0.572.10±0.35模型組8 12.35±2.14①14.72±2.21①5.74±0.59①恒清方低劑量組8 15.33±1.3812.26±2.145.68±0.32恒清方中劑量組8 25.57±3.05②④ 9.36±1.20②④4.81±0.22②④恒清方高劑量組8 31.12±5.26③⑤⑥⑦ 6.11±0.65③⑤⑥⑦2.88±0.35③⑤⑥⑦尼莫地平組8 26.04±4.76②④ 8.98±0.74②④3.49±0.27②④

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01；與恒清方低劑量組比較，④P<0.05，⑤P<0.01；與恒清方中劑量組比較，⑥P<0.05；與尼莫地平組比較，⑦P<0.05。

2.5 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組IL-6、TNF、IL-1β水平均升高(P<0.01)。與模型組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組IL-6、TNF、IL-1β水平均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方低劑量組比較，恒清方中劑量組、高劑量組和尼莫地平組IL-6、IL-1β、TNF水平均降低(P<0.05或P<0.01)；與恒清方中劑量組比較，恒清方高劑量組IL-6、IL-1β、TNF水平均降低(P<0.05)；恒清方高劑量組與尼莫地平組IL-6、IL-1β、TNF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠IL-6、IL-1β、TNF水平比較 (±s) 單位：pg/mL

與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01；與恒清方低劑量組比較，④P<0.05，⑤P<0.01；與恒清方中劑量組比較，⑥P<0.05；與尼莫地平組比較，⑦P<0.05。

3 討 論

腦缺血損傷為級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，在缺血性神經(jīng)元損傷中自由基激發(fā)發(fā)揮重要作用[11]。一定程度上，SOD活性表明機(jī)體抗氧化能力，MDA表明細(xì)胞受損傷程度，而NO參與缺血性損傷的病理機(jī)制[12]。炎癥反應(yīng)在CIRI機(jī)制中發(fā)揮重要作用[13]。IL-1β既可促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞活化，也可誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生、白細(xì)胞浸潤(rùn)的增多、黏附分子的表達(dá)等。IL-6是腦缺血急性期重要的炎癥介質(zhì)。TNF在腦缺血再灌注后誘導(dǎo)的白細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷中發(fā)揮重要作用。長(zhǎng)期臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方恒清方治療缺血性腦血管病療效滿意[2-5]，并已申請(qǐng)國(guó)家專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枺?01810677065.8)，但其作用機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，恒清方(中、高劑量)可降低IL-6、IL-1β、TNF水平，減輕缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，改善腦組織微環(huán)境(P<0.05或P<0.01)；恒清方(中、高劑量)可降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦指數(shù)、腦含水量，減小腦梗死面積(P<0.05或P<0.01)，提高腦組織SOD活性(P<0.05或P<0.01)，降低MDA、NO水平(P<0.05或P<0.01)，同時(shí)降低血清IL-6、TNF、IL-1β水平(P<0.05或P<0.01)。恒清方上述作用均存在量效關(guān)系，即隨著恒清方劑量增加，其作用越來(lái)越強(qiáng)，即恒清方高劑量>恒清方中劑量>恒清方低劑量，且恒清方高劑量作用優(yōu)于尼莫地平(P<0.05)。

綜上所述，中藥恒清方可改善SD大鼠腦缺血再灌注損傷，且其量效關(guān)系呈正相關(guān)，具體機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化作用有關(guān)。