肉蓯蓉多糖通過激活Wnt/β-catenin信號通路對6-HODA致帕金森病大鼠的神經保護作用

帕金森癥(Parkinson′s disease，PD)是世界范圍內發病率僅次于阿爾茨海默病的第二大神經系統退行性疾病，臨床表現為靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩等，病理特征為腦黑質致密部多巴胺神經元損傷，紋狀體多巴胺水平下降[1-2]。Wnt/β-catenin信號通路在中樞神經發育過程中發揮重要作用，該信號通路在PD發病過程中的作用受到越來越多關注[3]。肉蓯蓉是列當科植物肉蓯蓉的干燥帶鱗葉肉質莖，具有神經保護、提高免疫力、抗衰老等多種功能[4]。有研究證實，肉蓯

蓉的有效成分肉蓯蓉多糖(cistanche deserticola polysaccharides，CDPS)通過多種細胞因子調節PD動物模型的臨床癥狀[5]，但CDPS對Wnt/β-catenin信號通路是否具有調節作用報道較少。本研究旨在探討CDPS能否通過激活Wnt/β-catenin信號通路對6-羥多巴胺(6-HODA)所致PD大鼠的受損神經起到保護作用，為PD提供新的治療思路和研究靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性成年SD大鼠45只，周齡6～7周，體重200 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。造模前實驗動物飼養于SPF級環境1周。

1.2 實驗試劑 肉蓯蓉生藥由我院中藥房提供，提取CDPS；6-HODA、抗壞血酸購自美國Sigma公司；兔抗Wnt、β-catenin單抗購自美國Cayman公司；糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 PD大鼠動物模型建立 隨機選取SD大鼠30只，以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，將實驗動物固定于腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，鈍性分離頭骨外膜，參考大鼠腦定位立體圖譜，確定右側紋狀體坐標(前囟前1.0 mm，中線右3.0 mm，硬膜下4.5～5.0 mm)，將8 μg的6-HODA溶于含0.2%壞血酸的生理鹽水中，使用微量注射器抽取后，以1 μL/min速度注射于上述兩個靶點，注射后停針10 min，之后緩慢退針(2～3 min)。建模成功標準：建模1周后，腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，誘發大鼠旋轉，大鼠恒定向左旋轉，且30min內旋轉圈數>210圈視為造模成功。

1.4 實驗動物分組及干預方法 將45只大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(PD組)和肉蓯蓉多糖治療組(CDPS+PD組)，各15只，每組進行不同干預。

1.4.1 CDPS+PD組 造模3周后，每日給予造模成功的SD大鼠CDPS灌胃治療，劑量為1.08 g/(kg·d)，連續治療10 d。

1.4.2 PD組 造模3周后，每日給予造模成功的SD大鼠與CDPS+PD組相同體積的生理鹽水灌胃處理，連續治療10 d。

1.4.3 Sham組 手術過程同PD組，只是注射等體積生理鹽水，3周后每日給予SD大鼠與CDPS+PD組相同體積的生理鹽水灌胃處理，連續治療10 d。

1.5 實驗動物行為學觀察

1.5.1 游泳實驗 第32天，將SD大鼠置于一個20cm×20cm×25cm體積水缸內，水深10cm，水溫20～22℃，安靜環境下，記錄SD大鼠5min內靜止時間。

1.5.2 自主活動實驗 第32天，制作一個30 cm×30 cm×15 cm的有機玻璃盒，底部標注6 cm×6 cm方格，置于安靜、昏暗環境中，統計SD大鼠5 min內站立次數，連續觀察5次，取平均值。

1.6 組織標本提取 第32天，將SD大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，仰位固定于工作臺上，沿腹中線剪開皮膚，暴露腹腔，預冷生理鹽水灌注心臟，取腦組織，于-80 ℃條件下保存。

1.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測SD大鼠腦黑質內Wnt1、β-catenin蛋白表達 將凍存的腦組織剪成碎塊，加入蛋白裂解液，離心后取上清液，電泳分離蛋白，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)，使用含5%脫脂乳粉的TBST封閉，按順序添加一抗、二抗，洗滌NC膜，增強化學發光法(ECL)顯色，膠片掃描后使用Bandscan5.0軟件分析蛋白條帶灰度。

1.8 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測GSK-3β mRNA表達 將凍存腦組織加液氮研磨，使用Trizol提取總RNA，行逆轉錄反應。取2 μL RNA進行PCR擴增：內參為β-actin，內參引物序列，正向引物：TCGGCTATTCGGCTAGCTAGC；反向引物：TCGGTCGATTAGCTAGCCGCA；GSK-3β mRNA引物序列，正向引物：TCGATTCGATCGGGCTAGCTA；反向引物：TACGGTAGCGGCTAGCTAGG。擴增條件：95 ℃預變性2 min，1個循環；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環；72℃總延伸6 min。取5 μL PCR擴增產物進行電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，分析目的基因和參比基因的條帶灰度。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學觀察結果比較 與Sham組比較，PD組游泳靜止時間增加(P<0.05)，CDPS+PD組游泳靜止時間較PD組縮短(P<0.05)；PD組自主活動站立次數較Sham組下降(P<0.05)，CDPS+PD組站立次數明顯恢復(P<0.05)。詳見表1。

組別只數游泳靜止時間(s)自主活動站立次數(次)Sham組1595.93±7.31①21.18±4.22①PD組 15172.19±19.02 10.24±2.35 CDPS+PD組15128.03±10.33①17.74±4.20①

與PD組比較，①P<0.05。

2.2 各組大鼠腦黑質內Wnt1蛋白表達 PD組大鼠腦黑質內Wnt1蛋白表達少于Sham組(P<0.05)，且CDPS+PD組Wnt1蛋白水平較PD組提升(P<0.05)。詳見圖1。

與PD組比較，＊P<0.05。

2.3 各組大鼠腦黑質內β-catenin蛋白表達 PD組大鼠腦黑質內β-catenin蛋白水平低于Sham組(P<0.05)，CDPS+PD組大鼠腦黑質內β-catenin蛋白水平高于PD組(P<0.05)。詳見圖2。

與PD組比較，＊P<0.05。

2.4 各組大鼠腦黑質內GSK-3β mRNA表達 PD組大鼠腦黑質內GSK-3β mRNA高于Sham組(P<0.05)，CDPS+PD組腦黑質內GSK-3β mRNA較PD組下降(P<0.05)。詳見圖3。

與PD組比較，＊P<0.05。

3 討 論

PD是由中腦黑質多巴胺神經元選擇性退行性病變引起的[2]。近年來，Wnt信號通路在PD中的作用日益重視。Wnt根據細胞內信號通路不同分為兩類，在Wnt/β-catenin通路中發揮作用的是Wnt1，該通路是所有Wnt通路中重要的一條[6]。該通路在PD小鼠模型中腦黑質多巴胺神經元病理生理過程中發揮重要作用[3]。動物實驗證實，干擾小鼠中腦β-catenin嚴重減弱多巴胺神經元再生能力及多巴胺神經元完整性[7]；體外研究證實，Wnt1在中腦前體細胞中促進其分化為多巴胺神經[8]，同時Wnt1缺失導致多巴胺神經元增殖能力下降[9]。本研究結果可見，6-HODA所致PD大鼠腦黑質組織Wnt1和β-catenin表達較Sham組大鼠均較低，說明PD大鼠腦組織內Wnt1和β-catenin作用被阻斷，該結果與相關研究[8-9]報道一致。

GSK-3β是Wnt/β-catenin通路重要組成分子，該通路激活后，GSK-3β活性被抑制，從而增加β-catenin穩定性[10]。Gong等[11]研究發現，6-HODA能激活GSK-3β，進而導致中樞神經細胞凋亡，同時GSK-3β阻斷劑可抑制PD大鼠神經元凋亡；另有研究報道，中腦多巴胺前體細胞抑制GSK-3β活性可增加β-catenin水平，同時促進多巴胺神經元增殖和分化[12]。本研究結果顯示，給予SD大鼠顱內注射6-HODA后，GSK-3β mRNA表達高于Sham組，說明6-HODA能激活GSK-3β使其表達上調，同時抑制Wnt/β-catenin通路活性。

肉蓯蓉具有免疫調節、抗氧化、抗衰老等作用[4]。有研究證實，肉蓯蓉的有效成分在中樞神經保護方面發揮重要作用，對腦卒中、PD、阿爾茨海默病等中樞神經退行性疾病具有良好的防治作用[5]。有研究證實，肉蓯蓉中苯乙醇總苷能改善PD小鼠臨床癥狀，提高紋狀體內多巴胺水平[13]；另有研究發現，松果菊苷(ECH)通過抗氧化作用而減少氧化應激反應，保護多巴胺神經元免受氧化應激損傷[14]。CDPS是肉蓯蓉的一種主要化學成分，其對PD的防治研究目前報道較少。本研究采用CDPS干預6-HODA所致的帕金森SD大鼠，治療后SD大鼠自主活動能力提高，腦黑質內Wnt1和β-catenin蛋白表達較PD組提高，GSK-3β基因表達受到抑制，說明CDPS能改善PD大鼠臨床癥狀，這種作用可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路而產生的。

綜上所述，CDPS可改善6-HODA所致PD大鼠臨床癥狀，這種作用可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制GSK-3β活性而發揮多巴胺神經保護作用而實現的。今后將進一步從細胞分子水平探討肉蓯蓉對PD動物模型中樞神經細胞保護作用的具體機制。