miR-125a-5p抑制劑對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

心肌缺血再灌注(ischemia and reperfusion，I/R)損傷由Jennings在1960年首次于犬類心臟冠狀動脈結(jié)扎模型中描述[1]。研究發(fā)現(xiàn)血液再灌注后增加心肌壞死速度。心肌I/R損傷導致炎癥應答，并對缺血部位多種組織造成進一步損傷，如促進相關組織凋亡等。由心肌缺血導致的急慢性炎癥應答對心臟功能退化具有重要影響[2-3]。心肌缺血性心臟病是目前主要的致死性疾病之一[4-5]。及時的血液再灌注是降低死亡率的有效手段，但再灌注本身導致一系列組織損傷和病理異常，如心臟收縮功能降低、心肌細胞代謝異常、內(nèi)皮細胞功能障礙、壞死和凋亡等[6-7]。引起再灌注損傷的主要因素為一氧化氮(NO)、超氧化物和過氧化亞硝酸鹽等產(chǎn)生[7-8]。microRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小RNA分子，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達[9]。microRNAs通過調(diào)控基因表達影響多種細胞活動和功能，如細胞增殖、凋亡和分化等[10-11]。有研究表明，miR-125a-5p在多發(fā)性骨髓瘤細胞中抑制p53通路促進細胞增殖和遷移，并抑制腫瘤細胞凋亡[12]。但針對miR-125a-5p對心肌I/R損傷相關機制報道較少。本研究探討miR-125a-5p抑制劑對大鼠心肌I/R損傷模型中的影響，以期為心肌I/R損傷疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：C0105)均購自碧云天公司。熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：RG005-1)購自碧云天公司。大鼠超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(貨號：QYS-03061)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(貨號：QYS-231069)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(貨號：QYS-03052)均購自齊一生物科技(上海)有限公司。白介素-6(IL-6)(貨號：ab6672)、Bax(貨號：ab53154)、Bcl-2(貨號：ab692)、信號傳導與活化轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)(貨號：ab119352)、GAPDH(貨號：1056)一抗購自美國abcam公司、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。SYBR PCR Master Mix(貨號：4309155)購自賽默飛公司。

1.2 實驗儀器 半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀及PCR儀均購于美國伯樂公司；Mμltiskan GO酶標儀購自Thermo；Gel View 6000化學發(fā)光凝膠成像儀購于廣州云星儀器有限公司。分析天平ME204購自梅特勒托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。-86 ℃超低溫冰箱DW-86L578J、-25 ℃低溫保存箱DW-25L262h和2～8 ℃醫(yī)用冷藏箱HYC-310購自海爾公司。Eppendorf臺式冷凍離心機5702R購自德國艾本德股份公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠心肌I/R損傷模型的構(gòu)建 將30只8周齡健康Wistar大鼠(維通利華)隨機分為假手術組(sham組)、I/R損傷組(I/R組)和I/R+miR-125a-5p抑制組。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉鹽(50 mg/mL)進行麻醉，置于操作臺上并使用小動物呼吸器維持呼吸(60次/min)，潮氣量為13～15 mL。在第4肋骨處進行開胸，左冠狀動脈胸前下肢進行結(jié)扎阻斷血管30 min后，恢復血管通暢后縫合胸腔；sham組進行同樣處理但不結(jié)扎血管；建立大鼠sham組和I/R損傷模型。其中I/R+miR-125a-5p抑制組在血液再灌注前給予心肌層注射miR-125a-5p抑制劑(0.2 μL/g)。所有大鼠再灌注24 h后處死。

1.3.2 熒光素酶報告實驗測定STAT3和miR-125a-5p結(jié)合位點熒光素酶活性 利用生物信息學網(wǎng)站預測STAT3和miR-125a-5p結(jié)合片段，使用定量即時聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)擴增STAT3兩者的結(jié)合片段，并將該結(jié)合片段插入到PC-DNA中，構(gòu)建野生(wild type，wt)STAT3質(zhì)粒，再利用突變技術將結(jié)合位點突變，構(gòu)建STAT3突變(mutant type，mut)質(zhì)粒。使用野生STAT3質(zhì)粒、STAT3突變質(zhì)粒和miR-125a-5p模擬物(mimic)分別或同時對細胞進行轉(zhuǎn)染。細胞分為4組：STAT3 wt組、STAT3 wt+miR-125a-5p mimic組、STAT3 mut組和STAT3 mut+miR-125a-5p mimic組，采用Luciferase報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.3.3 qRT-PCR檢測心肌組織細胞相關RNA水平 取解剖后心肌組織，使用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度、純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用PCR儀器進行擴增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒測定STAT3和miR-125a-5p表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。實驗所用引物均采用Primer 3 Plus網(wǎng)站設計，由蘇州金唯智生物科技有限公司提供合成，實驗重復3次。

1.3.4 HE染色 切片經(jīng)3次二甲苯脫蠟，每次時間分別為15 min、15 min、10 min；梯度乙醇進行脫苯，分別使用100%、90%、80%、70%乙醇各脫苯10 min；蒸餾水緩慢沖洗5 min，2次；蘇木素染細胞核15 min，蒸餾水緩慢沖洗；0.5%鹽酸乙醇分色后，用蒸餾水緩慢沖洗15 min；70%和80%乙醇先后各浸泡10 min，復染伊紅1 min，90%乙醇進行分化10 s；95%乙醇脫水2次，每次10 min，100%乙醇進行脫水2次，每次15 min，二甲苯透明3次，每次時間分別是10 min、15 min、15 min；中性樹脂進行封片觀察。

1.3.5 免疫組織化學法分析組織抗原表達 將組織從-86 ℃冰箱取出后使用磷酸溶液(PBS)緩沖液清洗8次，去掉壞死組織和血凝塊。4%多聚甲醛于4 ℃固定24 h。PBS緩沖液清洗3次，再用30%、50%和70%乙醇依次清洗，脫水，石蠟包埋。1%聚乙二醇辛基苯基醚(triton-100)進行處理15 min，3%的H2O2進行處理15 min。5%羊血清封閉30 min后，依次孵育一抗及二抗。染色封片。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測炎癥因子 取心臟組織，經(jīng)液氮凍干研磨后收集組織樣品，加1 mL PBS緩沖液混勻后低溫離心機以4 000 r/min離心8 min，取上清液供實驗使用。加樣設置：分別設空白孔，標準品孔待測樣品孔。酶標包被的板子上加標準品50 μL，先加入樣品稀釋液40 μL于待測樣品孔，之后加待測樣品10 μL。孵育：封板后置于37 ℃環(huán)境進行30 min孵育。液體配制：將30倍洗滌母液經(jīng)蒸餾水稀釋30倍保留備用。洗滌：緩慢揭掉封板膜，將液體棄去，甩干液體，每孔加洗滌液，放置30 s之后棄去，反復重復5次，拍干板子。加酶：每孔加酶標試劑50 μL，空白孔不加。孵育：再次封板后放37 ℃孵育30 min。洗滌：小心取掉封板膜，甩去液體，甩干液體，每孔加適量洗滌液，放置30 s之后棄去，反復重復5次，拍干板子。顯色：各孔加入顯色劑A液50 μL，再加顯色劑B液50 μL緩慢震蕩混勻后，37 ℃避光進行顯色10 min。終止：各孔加入50 μL終止反應液，反應終止(終止后藍色立即轉(zhuǎn)為黃色)。測定：用空白孔進行調(diào)零，450 nm波長下依次測量每孔吸光值(OD值)。測定在加入終止液后的15 min內(nèi)進行。

1.3.7 免疫印跡試驗(Western Blot)檢測細胞蛋白表達 收集各組大鼠組織細胞，經(jīng)液氮凍干研磨后收集研磨組織，添加有終濃度為1 mmol/L蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenyl methanesulfonyl fluoride，PMSF)細胞裂解液進行裂解，提取各組細胞總蛋白。用聚氰

基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進行)，10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，之后加入一抗于4 ℃封閉過夜，次日加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加電化學發(fā)光(ECL)曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%牛血清白蛋白(BSA)封閉后依次孵育相應一抗和二抗。顯色并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 STAT3與miR-125a-5p之間靶向性 經(jīng)過生物信息學技術預測STAT3 5′端與miR-125a-5p之間的序列差異表明，兩者具有高度互補性，顯示兩者具有一定靶向關系；對HEK299細胞進行miR-125a-5p處理后發(fā)現(xiàn)，與STAT3 wt組比較，STAT3 wt+miR-125a-5p mimic組熒光亮度減少；STAT3 mut組和STAT3 mut+miR-125a-5p mimic組與STAT3 wt組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖1。

與STAT3 wt組比較，＊P<0.01。

2.2 各組心肌細胞miR-125a-5p和STAT3表達水平 各組經(jīng)過相應處理后，取心肌組織，經(jīng)過組織總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qRT-PCR測定發(fā)現(xiàn)：與sham組比較，I/R組miR-125a-5p異常升高而STAT3表達水平受到抑制；與I/R組比較，I/R+miR-125a-5p抑制組miR-125a-5p表達受到抑制，而STAT3表達水平上調(diào)。詳見圖2。

與sham組比較，＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01。

2.3 miR-125a-5p抑制后改善大鼠心肌I/R損傷 經(jīng)組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，I/R組心肌細胞排列不規(guī)則，邊界模糊，細胞核溶解或消失，心肌細胞間隙增加，并伴有明顯的炎癥細胞浸潤；與I/R組比較，I/R+miR-125a-5p抑制組細胞排列相對整齊，細胞邊界逐漸清晰，細胞核基本正常，細胞間隙減小，浸潤細胞明顯減少。詳見圖3。

圖3 HE染色后各組心肌細胞損傷情況

2.4 miR-125a-5p抑制后降低IL-6活性 各組大鼠經(jīng)過相應處理后，取心臟組織經(jīng)固定和石蠟包埋后切片，免疫組化染色檢測炎癥因子IL-6表達水平顯示：與sham組比較，I/R組細胞IL-6表達水平增高；與I/R組比較，I/R+miR-125a-5p抑制組組織細胞IL-6表達水平明顯下調(diào)。詳見圖4。

圖4 免疫組化檢測各組心肌細胞IL-6表達水平

2.5 miR-125a-5p抑制后降低細胞內(nèi)氧化應激相關因子 ELISA檢測心肌組織細胞氧化應激相關因子SOD、MDA和GSH結(jié)果顯示：與sham組比較，I/R組組織細胞SOD和GSH表達水平降低，MDA表達水平升高；與I/R組比較，I/R+miR-125a-5p抑制組組織細胞SOD和GSH表達水平提高，MDA表達水平受到抑制。詳見圖5。

與sham組比較，＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01。

2.6 miR-125a-5p抑制后凋亡通路活性增強 Western Blot檢測心肌組織細胞凋亡通路相關分子結(jié)果顯示：與sham組比較，I/R組組織細胞內(nèi)Bcl-2和STAT3表達水平降低，Bax表達水平升高；與I/R組比較，I/R+miR-125a-5p抑制組組織細胞Bcl-2和STAT3表達水平提高，而Bax表達水平受到抑制。詳見圖6。

與sham組比較， ＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01。

3 討 論

缺血性心臟病是一種致命性心臟疾病，導致嚴重公共衛(wèi)生威脅[13-14]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)顯示，缺血性心臟病2012年已導致760萬人死亡；缺血性心臟病將成為2030年全球農(nóng)村和城市中第二大死亡因素[15]。治療缺血性心臟病的唯一方式是恢復并促進冠狀動脈血流再灌注，由此減少心肌細胞死亡并減少心肌功能紊亂的發(fā)生[16]。急速再灌注對心肌細胞造成較大損害，同樣導致細胞死亡[17]，其發(fā)生機制為再灌注導致心肌細胞產(chǎn)生大量氧自由基，促進心肌細胞凋亡發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)過I/R損傷后，心肌細胞產(chǎn)生大量氧自由基MDA，同時SOD和GSH等氧自由基清除分子表達水平下降。另一方面，發(fā)現(xiàn)凋亡通路相關蛋白表達水平增高，由此說明在I/R損傷中，大量產(chǎn)生的氧化自由基與心肌細胞凋亡密切相關。

miR-125是一類高度保守的miRNA家族，共3類同源物，包括：has-miR-125a，has-miR-125b-1和has-miR-125-2。該家族成員在多種疾病已證實明顯下調(diào)，具有抑制疾病進展的作用；另一些相關疾病中具有促進疾病進展作用。同時miR-125可靶向一系列基因，如轉(zhuǎn)錄因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、Bcl-2家族蛋白等，異常表達導致細胞異常增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，甚至誘發(fā)腫瘤[19]。現(xiàn)有報道證實，miR-125a-5p被抑制后導致巨噬細胞對脂類物質(zhì)攝取增加，并促進氧化低密度膽固醇受體-1的表達[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠心肌組織細胞比較，大鼠心肌細胞經(jīng)過I/R損傷后，細胞內(nèi)miR-125a-5p表達水平增高。說明miR-125a-5p在大鼠I/R損傷后發(fā)揮重要機制。

本研究I/R損傷細胞內(nèi)除發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p表達異常升高之外，同時發(fā)現(xiàn)STAT3表達受到抑制，推測miR-125a-5p可能與STAT3之間具有某種聯(lián)系。根據(jù)生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間具有較強的靶向關系；進一步通過熒光素酶實驗驗證這種猜測。有研究證實，miR-125a-5p可靶向STAT3，進而抑制甲狀腺功能衰退發(fā)生[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，對I/R損傷大鼠進行miR-125a-5p抑制劑使用后，不但有效降低I/R損傷細胞miR-125a-5p表達量，同時下調(diào)STAT3表達水平。因此推測，在I/R損傷大鼠心肌細胞內(nèi)，miR-125a-5p可有效靶向STAT3，促使細胞STAT3表達水平下調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在I/R損傷細胞中氧化應激產(chǎn)物MDA高表達，SOD和GSH等強還原分子表達水平受到抑制；另一方面，心肌組織細胞炎癥因子IL-6表達水平增高；同時伴有心肌組織細胞嚴重凋亡。有文獻報道，IL-6可抑制STAT3表達水平，進而抑制細胞凋亡的發(fā)生[22]。因此推測，大鼠心肌細胞I/R損傷后，造成IL-6高表達，從而抑制STAT3表達，進一步促進細胞凋亡發(fā)生。利用miR-125a-5p抑制劑對I/R損傷大鼠處理后發(fā)現(xiàn)，心肌組織細胞IL-6表達水平有效下調(diào)，且STAT3上調(diào)后伴有細胞凋亡抑制。說明miR-125a-5p抑制劑可有效解除STAT3對心肌細胞促凋亡的作用。

綜上所述，miR-125a-5p抑制劑可有效解除對STAT3表達的抑制，進一步降低Bax/Bcl-2表達，降低心肌細胞凋亡水平；同時降低細胞內(nèi)氧化應激產(chǎn)物MDA，增強SOD和GSH表達水平。這種保護作用與miR-125a-5p和STAT3相互作用具有一定的相關性。因此，靶向miR-125a-5p在大鼠心肌I/R損傷中具有重要意義。但涉及microRNAs調(diào)控通路復雜，明確具體信號轉(zhuǎn)導機制并選擇性阻斷關鍵分子可為解釋心肌I/R損傷機制提供理論指導。