釉基質蛋白衍生物對人牙周膜干細胞分化、增殖的影響觀察

張帆　任偉偉

【摘要】 目的 分析研究釉基質蛋白衍生物對人牙周膜干細胞分化及其增殖的影響。方法 3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者， 對人牙周膜干細胞進行分離培養， 檢驗分析表面抗原表達及其克隆形成率， 對其多向分化潛能進行鑒定， 分析在牙周膜干細胞上進行不同質量濃度的釉基質衍生物培養2周和4周， 依據 Von Kosas和Trichrome 染色法對牙周膜干細胞礦化結節形成和膠原合成情況進行分析， 依據Real time 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 法對成骨分化相關基因Ⅰ型膠原、RUX2及其骨鈣素表達情況進行檢測， 分析在牙周膜干細胞增殖情況檢測中3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2， 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT） 法與生長率法的作用。結果 相比牙周膜細胞克隆形成率0.42%、STRO-1-細胞克隆形成率0.21%， STRO-1+細胞（牙周膜干細胞）克隆形成率1.42%更高。表面抗原CD105表達率99.8%、CD29表達率99.7%、CD45表達率1.26%、CD44表達率98.8%。結論 釉基質衍生物在試驗中顯示為一定時間劑量效應關系， 利于牙周膜干細胞膠原合成， 形成礦化結節， 促使有效表達骨分化相關基因Ⅰ型膠原、RUX2及其骨鈣素， 對于牙周膜干細胞增殖十分有利， 具有再生和修復牙周組織的臨床作用。

【關鍵詞】 釉基質蛋白衍生物;人牙周膜干細胞;分化;增殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.11.086

牙周膜干細胞實際上是在牙周膜內存在的成體干細胞， 存在牙周再生能力和多向分化潛力， 在牙周組織中釉基質衍生物能夠再生， 可對細胞增殖、定向分化作用進行刺激[1]。釉基質衍生物實際上是取自于發育期牙釉組織的一種物質， 釉質蛋白為主要成分， 雖然釉基質衍生物可對牙槽骨修復具有一定促進作用， 但還是存在不明確的機制。本文闡述了2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除的前磨牙及其2例埋伏第三恒牙的實驗效果?，F報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 本文選取2018年1月～2019年1月3例健康的因正畸原因拔除前磨牙及2例埋伏第三恒牙患者作為研究對象， 患者及其家屬表示對醫院給出的知情同意書簽字認可， 移交醫學倫理會得到批準。

1. 2 方法

1. 2. 1 牙周膜細胞分離培養 基于無菌環境下將離體牙牙根中1/3位置牙周膜進行小心分離， 在37℃下使用4 g/L胰蛋白酶和3 g/LⅠ型膠原酶進行1 h消化， 在10 cm培養皿上接種， 加入DMEM培養基， 主要涵蓋10%胎牛血清、100 g/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素G， 基于37℃在5% CO2培養箱內進行培養。

1. 2. 2 FACS分選 經5～7 d培養上述牙周膜細胞后， 通過Tryple E消化細胞， 在blocking buffer中重懸細胞， 放置在0℃環境內20 min， 使用2 mg/L、STRO-1免疫球蛋白M（IgM）抗體進行1 h孵育;通過流式細胞儀對STRO-1+細胞進行分選， 實施細胞傳代培養， 使用第2代或3代細胞展開相關實驗。

1. 2. 3 克隆形成率測定 在5 cm培養皿中接種400個牙周膜細胞、400個STRO-1-細胞、400個STRO-1+細胞， 在標準培養液中進行14 d的培養， 使用10%甲醛溶液固定后1% violet blue染色。1個克隆即為>50個細胞聚成的細胞集落?？寺⌒纬陕?每個培養皿中的克隆數/植入細胞數。

1. 2. 4 流式細胞儀表面抗原檢測 用Tryple E 消化第3代牙周膜干細胞后， 在 blocking buffer 中重懸細胞， 放置在0℃環境內20 min， 實施EP管分裝處理， 每管100 μl， 分別將CD105、CD44、CD34、CD45抗體加入1 μl進行1 h孵育， 重懸后將二抗加入再次控模型重懸， 通過流式細胞儀實施相關指標的檢測。

1. 2. 5 多向分化能力檢測 以5×107個/L細胞濃度將第2代牙周膜干細胞加入24孔板內進行24 h孵育， 更換培養液為成骨誘導液、成軟骨誘導液、成脂誘導液， 間隔3 d更換1次， 21 d后采用von kosa染色法對成骨誘導組培養板內礦化結節形成狀態進行觀察， 使用番紅O染色法對軟骨形成狀態進行觀察， 使用油紅O染色法對脂滴形成狀態進行觀察。

1. 2. 6 成骨分化相關指標檢測 分組培養第3代牙周膜干細胞， 將不同質量濃度的釉基質衍生物加入到相同的培養液中， 分別為20 mg/L釉基質衍生物、50 mg/L釉基質衍生物、100 mg/L釉基質衍生物， 放置到37℃環境下， 在5% CO2培養箱中進行2周及4周的培養。通過Trichrome染色法對膠原合成情況進行檢測：依據試劑相關說明書實施操作， 以10%甲醛溶液固定細胞后， 將Bouin's溶液加入后放置于56 ℃環境下1 h， 將Weigert鐵蘇木精染液放入10 min， 之后進行清洗， 加入比布列西酸性品紅液大約10～15 min后， 再加入苯胺藍溶液， 大約10 min后使用1%乙酸進行5 min清洗， 脫水后進行鏡下觀察。通過Von Kosas 染色法對礦化結節形成狀態進行檢測， 依據VonKosas染色法能夠把礦化結節染成黑色， 在對細胞爬片固定且PBS洗滌后， 置入到5%硝酸銀水溶液內10 min， 并且在日光下進行20 min曝曬后通過蒸餾水進行洗滌， 同時進行乙醇系列脫水， 二甲苯顯示為透明。通過RT-PCR法對成骨相關基因表達進行檢測， 進行2周及4周培養過程中收集細胞， 依據TRIzol法對總RNA進行抽提， 實施反轉錄后形成cDNA， 并且將其當做模板， 通過目標基因的引物開展Real time RT-PCR， 對目標基因的表達進行檢測。通過MTT法對細胞增殖情況進行檢測， 以每孔4×104個的濃度將第3代牙周膜干細胞種入到96孔板， 將不同濃度的釉基質衍生物加入進行48 h孵育， 以含5 g/L MTT PBS取代培養液， 基于37℃環境下使用5% CO2進行48 h孵育， 讀取570 nm波長處的吸光度值。細胞生長率：以每孔5 000個的密度種將第3代牙周膜干細胞置入到12孔培養板上進行24 h培養， 在無血清DMEM中進行24 h再培養， 在存在100 mg/L釉基質衍生物的培養基中進行2 d與4 d的再培養， 分析消化細胞后計數情況。

2 結果

2. 1 克隆形成率、細胞形態學 試驗研究顯示， 對細胞進行低密度接種后， 基于光鏡下進行觀察顯示出克隆樣生長。經14 d培養后， 相比牙周膜細胞克隆形成率0.42%、STRO-1-細胞克隆形成率0.21%， STRO-1+細胞（牙周膜干細胞）克隆形成率1.42%更高。

2. 2 牙周膜干細胞表面抗原表達情況 CD105表達率99.8%、CD29表達率99.7%、CD44表達率98.8%、CD45表達率1.26%， 證實， 牙周膜干細胞屬于間充質來源的干細胞。

2. 3 牙周膜干細胞多向分化能力情況 誘導分化牙周膜干細胞成骨后， 經Von Kosa染色處理顯示礦化結節;經成脂誘導培養后， 油紅O染色顯示脂滴;經過成軟骨誘導培養后番紅花精O染色顯示為陽性， 表示牙周膜干細胞存在多向分化潛能。

2. 4 釉基質衍生物對牙周膜干細胞成骨分化影響作用 膠原合成能力：通過Trichrome染色法對不同質量濃度的釉基質衍生物進行檢驗， 分別是0、20、50、100 mg/L， 試驗研究顯示， 釉基質衍生物可對牙周膜干細胞膠原合成進行促進， 且顯示為劑量效應關系;100 mg/L劑量具有最強的牙周膜干細胞分化促進作用。隨著試驗時間的增加延長， 釉基質衍生物不斷增加促進牙周膜干細胞膠原合成的臨床作用， 證實上述操作存在時間效應關系。

礦化能力：在牙周膜干細胞上以0、100 mg/L釉基質衍生物進行2、4周作用， 隨著時間的增加， 可顯著提升釉基質衍生物對于牙周膜干細胞礦化結節形成的促進作用。

成骨相關基因表達：在牙周膜干細胞上以0、100 mg/L釉基質衍生物進行2、4周作用， 通過Real time RT-PCR法對成骨基因Ⅰ型膠原、Runχ2表達及其骨鈣素進行表示， Runχ2表達：2周0 mg/L為1.53、100 mg/L為8.69， 4周0 mg/L為1.55、100 mg/L為6.58;Ⅰ型膠原表達：2周0 mg/L為1.11、100 mg/L為3.53， 4周0 mg/L為1.32、100 mg/L為6.53;骨鈣素：2周0 mg/L為1.66、100 mg/L為5.39， 4周0 mg/L為1.68、100 mg/L為7.99。證實， 隨著時間的增加， 可顯著提升釉基質衍生物對于牙周膜干細胞向成骨細胞分化的促進作用。

釉基質衍生物可將牙周膜干細胞活力增強， 隨著不斷增加質量濃度， 會增加促進作用， 0 mg/L為1.01， 20 mg/L為1.61， 50 mg/L為1.83， 100 mg/L為1.95;通過100 mg/L劑量實施細胞生長試驗， 表明隨著時間的增加， 明顯增加牙周膜干細胞數， 即為0 d為0.5×105， 2 d為1.5×105， 4 d為3.5×105。

3 討論

現階段臨床治療牙周炎疾病過程中促進組織修復、控制局部炎癥為主要方法。針對牙槽骨缺損患者最理想的臨床治療方法為牙槽骨再生， 但牙槽骨再生始終都是治療牙周炎疾病的重點和難點[2]。此外， 牙槽骨缺損和吸收引發的骨量不足， 也屬于種植牙治療的主要問題， 因具有不足夠的骨量， 導致種植體固位不良， 患者可能需要選擇移骨粉或者植自體骨等材料對骨量進行增加， 導致容易種植修復失敗或者放棄治療。如可將牙槽骨再生水平顯著提升， 能夠有效處理骨量不足導致的問題， 促使種植修復效果比較滿意[3-5]?，F階段在治療牙周病和修復牙周缺損過程中牙周骨移植及其引導組織再生術屬于常見方法， 但具有不理想的牙周組織生理功能和結構恢復效果。釉基質衍生物是取自發育期牙釉組織的一種物質， 釉基質衍生物利于牙周膜干細胞成骨對基因Ⅰ型膠原、RUχ2及其骨鈣素的分化[6-8]。

綜上所述， 釉基質蛋白能促進牙周膜細胞增殖、蛋白合成及礦化相關蛋白骨涎蛋白和骨橋蛋白的表達。

參考文獻

[1] 趙文華， 葉銀婷， 李燕燕， 等. 骨膜蛋白在人牙周膜干細胞成纖維表達中的研究進展. 口腔醫學， 2018， 38（4）： 364-367.

[2] 于彬， 舒獻碧， 黃詠梅. 1， 25-二羥基維生素D3對人牙周膜干細胞體外成骨作用的機制研究. 臨床和實驗醫學雜志， 2019， 18（4）：41-44.

[3] 李影， 劉娜， 張維， 等. Wnt經典通路β-catenin過表達對人牙周膜干細胞增殖能力及成骨能力的影響. 中華老年口腔醫學雜志， 2017， 15（4）：198-203.

[4] 黃飛， 丁潔， 張明燁， 等. 脂多糖對人牙周膜干細胞增殖及炎癥因子表達的影響. 牙體牙髓牙周病學雜志， 2017， 27（2）：86-88， 110.

[5] 鄭樹燦， 鄒暉， 黃旭瑤， 等. 低氧對人牙周膜干細胞增殖和分化的影響. 口腔醫學研究， 2019， 35（1）：38-41.

[6] 龍晏， 邱申彩， 李淑慧， 等. 過表達Notch1的胞內段基因對人牙周膜干細胞增殖能力影響. 口腔醫學研究， 2019， 35（1）：28-32.

[7] 邱申彩， 戴曉瑋， 龍晏， 等. 不同濃度γ-分泌酶抑制劑對人牙周膜干細胞骨向分化的影響. 中華口腔醫學研究雜志（電子版）， 2018， 12（6）：335-341.

[8] 米夢夢， 夏海斌， 王敏. 釉基質蛋白衍生物在口腔種植中的研究進展. 國際口腔醫學雜志， 2018（5）：522-526.

[收稿日期：2019-09-12]

基金項目：十堰市市級引導性科研項目（項目編號：17Y43）

作者單位：442000 湖北醫藥學院附屬口腔醫院

通訊作者：任偉偉