多巴胺及運動干預對胃癌大鼠腫瘤發生發展的影響

韓娟娟，趙師銳，張新安

（沈陽體育學院運動人體科學學院運動生理生化教研室，沈陽 110102）

胃癌是全球第四大常見癌癥之一，其死亡率居全球癌癥第二位，發病機制復雜且預后極差［1］?，F行的手術治療、化療和放療療效一般，胃癌防治策略研究迫在眉睫。多巴胺（dopamine，DA）作為重要的神經遞質，在胃組織中大量存在，與認知、情緒、應激和運動有關［2］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被認為是惡性腫瘤中最重要的血管生成細胞因子［3］。研究［4］證實外源性DA可通過抑制血管生成導致腫瘤細胞凋亡，具有明顯的抗腫瘤活性作用。運動與多巴胺能系統密切相關，游泳運動可以提高肝癌模型大鼠的DA水平，通過多巴胺D2受體（dopamine 2 receptor，D2R）顯著抑制肝癌的生長和肺轉移，延長生存時間［4-5］。基于上述研究現狀，本研究假設運動可能通過調節多巴胺能系統和腫瘤血管生成抑制胃腫瘤的生長，DA和運動干預可能有較好的抗腫瘤效應。本研究分析了DA和游泳運動對N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）誘 導的胃癌大鼠生存率、腫瘤組織DA、血清DA及VEGF水平的影響，為胃癌的防治及術后康復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

160只4周齡雄性Wistar大鼠購自中國醫科大學動物中心，體質量60～70 g。LC-6A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；TZD-CL-200S化學發光免疫分析儀（廈門天中達公司）；MNNG（日本東京化成工業株式會社）；鹽酸多巴胺、多潘立酮、高氯酸、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鉀和氯化鉀、二甲基亞砜（美國Sigma-Aldrich公司）；ELISA試劑盒（上海市恒遠生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作：所有Wistar大鼠先進行1周的適應性游泳訓練，游泳水槽體積 60 cm×50 cm×50 cm，水深25 cm，水溫34 ℃左右，環境溫度為（22±4.1）℃，光照周期12 h ∶12 h，濕度55%±4%。二甲基亞砜作為溶劑，將MNNG配成20 %的溶液，加蒸餾水稀釋至80 mg/L，置于4℃冰箱中避光保存，將MNNG溶液作為160只4周齡雄性Wistar大鼠的日常飲用水，持續28周，然后停止MNNG溶液喂養，飲用正常蒸餾水持續22周，共50周。隨機選取并標記10只大鼠，用于造模及成瘤分析，10只標記大鼠無死亡情況，采用頸椎脫位的方式處死標記大鼠，發現8只大鼠出現胃腫瘤（腫瘤發生率80%），分離腫瘤組織后用微卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積（1.56±0.47）mm（按腫瘤直徑計算），提示造模成功，可進行后續實驗。

1.2.2 大鼠分組及干預方案：將剩余存活的129只（造模過程中死亡21只）MNNG誘導50周的Wistar胃癌大鼠稱重，選取體質量相差在9.5 g以內的100只大鼠，隨機分為A、B組（每組50只）。A、B 2組再分別隨機分為5組（每組10只）：腫瘤對照（Ca）組、游泳組（Sw）、DA組、DA+多潘立酮（DA+DP）組、游泳+DA（Sw+DA）組。Ca組不進行特殊干預，正常飲食休息，Sw組每天進行2次共60 min（中間休息5 min）的游泳運動，每周運動5 d。DA組每天腹腔注射DA（50 mg/kg）。DA+DP組在DA注射前給予多潘立酮（10 mg/kg，灌胃）。Sw+DA組每天游泳后注射DA。大鼠每次游泳運動結束后均及時吹干，避免著涼。觀察A組大鼠的死亡情況，每天記錄死亡數量，直到A組大鼠全部死亡，用于生存率分析。B組干預6周后，用靜脈穿刺法抽取血液，處死所有存活大鼠，分離胃腫瘤組織冷藏備用，用于測定血清DA、VEGF水平、腫瘤組織DA水平以及腫瘤體積變化情況。本研究實驗動物的利用符合中國醫科大學動物倫理委員會的規定。

1.2.3 DA水平測定：采用高效液相色譜-電化學檢測法對血清和胃腫瘤組織進行DA檢測。將腫瘤組織稱重，加入10.2 mL的0.6 mol/L高氯酸中勻漿，高氯酸中含有1.7 mg/mL乙二醇四乙酸和1.1 mg/mL還原性谷胱甘肽，0 ℃ 2 500g離心15 min，上清1.0 mL，加入6 mol/L氫氧化鉀調pH至8.6，分批萃取后進行DA濃度測定。在25 μL氯化鉀（3 mol/L）中加入200 μL高氯酸（0.2 mol/L）洗脫液，離心，取上清液，將50 μL上清液注入高效液相色譜系統。抽取后的血液立即置于真空促凝采血管中，4 ℃冷藏柜保存1 h后離心（3 000 r/min，15 min）取200 μL血清放入勻漿器，加入200 μL流動相和10 μL蛋白沉淀劑復溶，渦旋混合后，高速離心（12 000 r/min）10 min，取上清液，進樣50 μL。在上清液中，DA的靈敏度極限為0.01 ng/mL，定義為基線噪聲的2倍，如果濃度低于靈敏度極限，DA的濃度賦值為0。

1.2.4 血漿VEGF水平檢測：血樣以800 r/min，4 ℃離心30 min，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，80 ℃保存，根據制造商的方案，采用ELISA法測定血漿VEGF水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DA和游泳運動對胃癌大鼠生存率的影響

63 d DA和游泳運動干預后，Sw+DA組生存率明顯高于Ca組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖1。

2.2 DA和游泳運動對胃癌大鼠腫瘤生長情況、腫瘤組織DA水平、血清DA和 VEGF水平的影響

圖1 胃癌大鼠生存率變化情況Fig.1 Changes in survival rates in rats with gastric cancer

42 d DA和游泳運動干預后，與Ca組大鼠比較，DA、Sw+DA組大鼠胃腫瘤體積明顯縮小，血清和腫瘤組織DA水平明顯升高（均P＜ 0.05），Sw、DA、Sw+DA組大鼠血清VEGF水平明顯降低（P＜ 0.05）；與Sw組比較，DA、Sw+DA組腫瘤體積明顯縮小，血清和腫瘤組織DA水平明顯升高（均P＜ 0.05），Sw+DA組血清VEGF水平明顯降低（P＜ 0.05）；與DA組比較，DA+DP組腫瘤體積明顯增大，血清和腫瘤組織DA水平明顯降低，VEGF水平明顯升高（均P＜ 0.05），而Sw+DA組結果相反，腫瘤體積縮小，DA水平升高，VEGF水平降低（均P＜ 0.05）。見表1。

2.3 單一游泳運動、DA及游泳運動對胃癌大鼠血清DA、VEGF水平的長期影響

與基線比較，單一游泳運動后VEGF水平逐漸降低，42 d時出現統計學差異（P＜ 0.05）；DA及游泳運動干預后，與基線比較，DA水平逐漸升高，14 d、28 d、42 d時出現統計學差異（均P＜ 0.05），VEGF水平逐漸降低，28 d、42 d時出現統計學差異（均P＜0.05），見圖2。

3 討論

胃癌生存率低且預后極差，是全球癌癥死亡的主要原因之一［6］，由于該病的早期無特異性癥狀，多數患者確診時已處于晚期，目前治療方法主要是手術及術后放、化療且療效一般［7］，有關胃癌的防治策略研究一直是學者關注的重點。

表1 DA和游泳運動對各組大鼠腫瘤體積、DA、VEGF水平的影響（n=10）Tab.1 Effects of dopamine and swimming on tumor volume，DA，and VEGF levels of rats in each group（n=10）

圖2 游泳、DA及游泳對血清DA、VEGF水平的階段性影響Fig.2 Effects of swimming or DA treatment combined with swimming on serum DA and VEGF levels

DA是一種安全有效的藥物，外源性DA可通過D2受體抑制腫瘤細胞增殖［8］，廣泛應用于食管癌、胃癌等消化系統腫瘤中，具有明顯的抗腫瘤活性作用［4］。DA主要通過5種不同的G蛋白偶聯受體亞型對靶細胞發揮作用，根據其藥理特性分為D1和D2類受體，D1類包括D1R和D5R，D2類包括D2R、D3R和D4R［9］。內源性DA在調節胃的生理機能中發揮重要作用，如減少胃酸分泌、刺激碳酸氫鹽產生和黏液的分泌。研究［2，10］發現，D2R與腫瘤有關，在人類胃癌、膀胱癌和肝癌細胞中，DA和D2R水平明顯降低，DA與癌癥呈負相關。腫瘤血管生成對實體腫瘤的生長和發展至關重要，VEGF被認為是惡性腫瘤中最重要的血管生成細胞因子［3］，且受到D2受體的調控，VEGF過表達與腫瘤生長、微血管密度、增殖、轉移及預后有關［11］。研究［12］表明，VEGF及其受體VEGFR-2介導的血管生成信號傳導通路在胃癌的發生發展中起重要作用。DA 主要通過D2R抑制VEGF，進而抑制腫瘤組織血管生成和癌細胞的發展轉移，最終提高機體的生存率［4］，本研究通過MNNG誘導建立雄性Wistar大鼠胃癌模型，采用腹腔注射DA和多潘立酮灌胃的方式干預6周，發現DA可上調胃癌大鼠血清和癌組織中的DA水平，降低VEGF水平，多潘立酮幾乎完全阻斷了DA對胃癌的抑制作用，表明DA可通過D2R特異性地抑制VEGF介導的血管生成，抑制胃癌細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，最終提高其生存率。

近年來，運動療法在癌癥預防和術后康復中逐漸受到重視，運動不但可以減少不同類型惡性腫瘤的發病風險，還能抑制腫瘤增殖和轉移，延長生存時間［13-15］。研究［4］發現，運動對腫瘤的抑制作用可能與多巴胺能系統有關，運動通過激活腫瘤細胞D2R信號，使得外周血中DA水平上調，最終抑制癌細胞的發生和轉移。另外，運動可以下調結直腸癌、乳腺癌、肺癌VEGF表達，抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡［16-17］。因此推測運動可能通過調節多巴胺能系統和腫瘤血管生成來抑制胃癌發展，DA及運動干預可能是胃癌防治的有效策略。本研究結果顯示，DA及運動共同作用可提高胃癌大鼠DA水平，降低VEGF水平，抑制胃癌細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，有效延長胃癌大鼠的生存時間。單一DA療法可上調胃癌大鼠DA水平，下調胃癌大鼠VEGF水平，提高生存率，但效果低于運動與DA的共同作用。單一游泳運動可降低胃癌大鼠血清VEGF水平，但對大鼠的生存率和DA水平無影響，說明游泳運動對抑制胃癌血管形成有一定作用，但對抑制胃癌大鼠腫瘤組織生長、提高生存時間作用不明顯。DA與游泳運動共同作用比單純DA、游泳運動對胃癌有更強的抑制作用，提示運動可作為胃癌治療的輔助手段，可加強DA對胃癌的抑制。此外，為了分析DA及運動對胃癌大鼠血清DA和VEGF水平的長期影響，分別在基線、7 d、14 d、28 d、42 d檢測了大鼠血清DA和VEGF水平，發現單純游泳運動持續降低胃癌血清VEGF水平，但對血清DA水平影響不明顯。運動與DA共同作用對血清DA和VEGF水平有持續影響，可升高血清DA水平（14 d起效），降低血清VEGF水平（24 d起效）。

本研究發現，DA及其受體D2R可抑制胃癌大鼠血管生成，證明了DA作為胃癌藥物治療的可行性，D2R可能作為一個新的胃癌治療的潛在靶點，值得深入研究。本研究中，雖然單一游泳運動對胃癌大鼠DA和腫瘤生長未產生明顯影響，但運動干預作為一種輔助治療方式，值得在腫瘤防治中深入探索。

綜上所述，DA及運動干預可抑制胃癌大鼠腫瘤細胞的發生發展，提高其生存率。其效果優于單一的DA注射或者運動干預，運動可能作為一種有效的胃癌藥物治療輔助手段。DA可通過D2R特異性地抑制VEGF介導的血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，DA及其受體D2R可作為胃癌治療新的潛在靶點，值得進一步探索。