轉Pi9抗稻瘟病基因水稻株系的比較轉錄組分析

許趙蒙 李利華 高曉慶 袁正杰 李莘 田旭丹 王嵐嵐 瞿紹洪, *

轉抗稻瘟病基因水稻株系的比較轉錄組分析

許趙蒙1, 2李利華2, 3高曉慶1袁正杰2李莘2田旭丹1, 2王嵐嵐2瞿紹洪2, *

(1浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，杭州 310021；3湖南農業大學 植物保護學院，長沙 410128；*通信聯系人，E-mail: squ@mail.zaas.ac.cn)

【】在轉錄水平上解析基因介導的稻瘟病抗性調控機理，為培育抗病水稻品種提供理論依據。向水稻品種日本晴（NPB）及其轉抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)接種稻瘟菌。分別于接種后0 h、12 h、24 h、36 h提取葉組織樣品，選取12 503個水稻基因定制基因芯片，進行水稻基因轉錄組分析，并通過qRT-PCR對部分差異表達基因進行驗證。NPB/Pi9在接種后12 h、24 h和36 h的基因表達量分別與其接種0 h表達量比較，共檢測到7 754個差異表達基因；相應地，感病水稻NPB在以上時間點共檢測到7 385個差異表達基因；在接種后36 h，NPB/Pi9的差異表達基因數目顯著多于NPB。比較NPB/Pi9和NPB相同時間點的基因表達量，共獲得4 065個差異表達基因，其中接種后36 h的差異表達基因顯著多于接種后0 h、12 h或24 h。因此，NPB/Pi9的稻瘟病防御反應更強烈。對NPB/Pi9與NPB相同時間點的差異表達基因進行GO和KEGG分析，細胞外區域、植物對刺激應答、轉錄調控、氧化還原、離子結合、次生代謝和植物激素相關的GO分類在接種后呈顯著富集，苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和植物激素信號途徑的KEGG通路在接種后顯著富集。與效應分子觸發的免疫反應(ETI)相關的水楊酸信號途徑、幾丁質酶，以及與病原相關分子模式觸發的免疫反應(PTI)相關的胞外區域、對刺激的應答、木質素合成等，均在抗感水稻之間差異表達。而且PTI/ETI共有的WRKY轉錄因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信號途徑等發生差異表達。綜上所述，NPB/Pi9和NPB的差異表達模式與ETI和PTI相關，兩者相互聯系并在介導的稻瘟病抗性中發揮作用。與日本晴比較，抗病基因型NPB/Pi9對稻瘟病防御反應更強烈。轉錄因子、激酶、基因、幾丁質酶、水楊酸、茉莉酸和乙烯信號途徑，以及植物次生代謝在介導的稻瘟病抗病反應中發揮重要作用。

水稻稻瘟?。晦D錄組；抗病基因；植物激素；次生代謝

水稻()是重要糧食作物之一。由水稻稻瘟病菌()引起的稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一，是限制水稻高產穩產的主要因素[1]。水稻基因是目前水稻育種中廣泛使用的廣譜抗稻瘟病基因之一[2]。編碼NBS-LRR抗病蛋白[3]。Pi9蛋白與稻瘟病菌無毒效應蛋白AVR-Pi9互作從而誘導水稻抗病反應[4]?；蚴腔虻闹匾蓡T，在效應分子觸發的免疫反應（effector-triggered immunity, ETI）即病菌小種特異性抗病反應中起重要作用[5]。基因介導的ETI信號轉導途徑主要包括絲裂原激活的蛋白激酶信號途徑、WRKY等轉錄因子啟動的基因表達以及水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和乙烯(ethylene, ET)等抗病激素的基因調控[6]。

宿主基因轉錄調節是植物防御反應的中心部分，而闡明基因表達差異的調控機制是理解植物抗病分子基礎的關鍵[7]。Wei等[8]利用基因芯片技術研究基因介導的水稻免疫反應，發現WRKY轉錄因子在水稻抵抗稻瘟病的過程中發揮重要作用。Zhang等[9]對具有稻瘟病部分抗性的-RNAi轉基因水稻株系進行轉錄組分析，解析了介導的水稻防御反應和信號轉導途徑。

明確水稻抗病感病基因型的基因表達差異，是解析抗病機理和培育抗病品種的基礎。Li等[10]對水稻抗病品種地谷（含和抗稻瘟病基因）與感病品種麗江新團黑谷進行比較轉錄組分析，根據稻瘟病菌附著胞成熟之前地谷啟動防御基因的表達，鑒定出水稻早期防御中發揮重要作用的受體激酶基因。Kitony[11]以水稻感病品種CO39及其回交轉育抗稻瘟病基因的5個近等基因系為材料，進行抗感基因型比較轉錄組分析，發現表達基因的數量、功能、共表達模塊等的差異導致供試水稻品種具有不同稻瘟病抗性水平。Meyers等對轉日本晴水稻株系和未轉化日本晴的稻瘟菌接種水稻樣品進行比較轉錄組分析，建立了水稻與稻瘟菌分子互作的MPSS數據庫（https://mpss.danforthcenter. org/mpss/rice/）。

本研究以日本晴水稻遺傳背景的轉基因抗稻瘟病株系和感病的日本晴為材料，利用基因芯片技術，對稻瘟病菌接種水稻樣品進行比較轉錄組分析，并對部分差異基因進行驗證，在轉錄水平上解析相關的抗病調控機理，為抗稻瘟病水稻育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 水稻材料育苗

供試水稻材料為日本晴（NPB）及其轉基因抗稻瘟病水稻株系（NPB/Pi9）。挑選籽粒飽滿、無霉斑水稻種子，置于羊皮紙袋，37℃下浸種發芽5 d后移栽入盆，每盆種植抗感基因型兩種材料各5~8株。在24℃~26℃、14 h光照/10 h黑暗、濕度85%的生長箱中生長10 d，用于稻瘟菌接種。

1.2 水稻稻瘟病菌噴霧接種和取樣

水稻稻瘟病菌株KJ201在CM培養基上活化培養12 d，用0.02%吐溫20孢子洗脫液制備孢子懸浮液，調整孢子濃度至5×105個/mL，對水稻植株進行噴霧接種。分別于接種后0 h、12 h、24 h、36 h用無菌剪刀剪取水稻葉片組織，液氮速凍后保存于–80℃超低溫冰箱備用。

1.3 差異基因篩選及GO分類富集分析

從稻瘟菌侵染條件下水稻MPSS和SBS轉錄組數據(美國丹佛斯植物研究中心和俄亥俄州立大學，https://mpss.danforthcenter.org/mpss/rice/)一共選取 12 503個水稻基因，包括、類受體蛋白激酶、E3連接酶、轉錄因子、SNARE蛋白、鈣依賴性激酶等抗病相關基因。委托上海伯豪生物技術公司定制基因芯片，檢測抗病基因型NPB/Pi9和感病基因型NPB響應稻瘟菌侵染的實時轉錄譜。

根據基因芯片雜交檢測信號，計算每個基因接種后0 h的相對表達量（記為0 hexp），以及接種后12 h、24 h和36 h的相對表達量（分別記為12hexp、24hexp和36hexp）。把每個水稻材料（NPB/Pi9或NPB）各接種時間點的基因表達量與其接種后0 h的表達量比較，計算表達量比值（12hexp/0hexp、24hexp/0hexp和36hexp/0hexp），以此作為每個材料的每個基因隨時間變化發生差異表達的量值。計算抗感基因型NPB/Pi9與NPB中同一基因在相同時間點表達量的比值（0hexp-Pi9/0hexp-NPB、12hexp-Pi9/12hexp-NPB、24hexp-Pi9/24hexp-NPB和36hexp-Pi9/36hexp-NPB），作為抗感基因型在相同時間點表達差異的量值。將表達量比值不小于2或不大于0.5的基因認定為差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。

利用Goatools在線軟件(https://github.com/ tanghaibao/GOatools)對抗感基因型NPB/Pi9和NPB之間的差異表達基因進行GO分類富集分析。將值小于0.05的GO分類視為顯著富集項。利用KOBAS在線軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對以上抗感基因型之間的差異表達基因進行KEGG富集分析，將值小于0.05的KEGG通路定義為顯著富集通路。

1.4 水稻RNA提取及qRT-PCR驗證

參照Trizol總RNA提取試劑說明書，從稻瘟病菌侵染的水稻樣品提取總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司）檢測RNA質量和濃度。參照FastQuant反轉錄試劑盒說明書(TIANGEN公司)進行cDNA第1鏈合成。以EF-Tu(Os03g08020)為內參基因；使用NCBI引物設計工具（Primer3和Primer-BLAST）設計水稻基因RT-PCR引物(表1)；使用SYBR Premix ExⅡ(2x)熒光染料法實時定量試劑盒(TaKaRa公司)，ABI PRISM7900?HT實時熒光定量PCR檢測系統（ABI公司）進行qRT-PCR。每個PCR設置3次重復。按照2方法定量分析qRT-PCR數據。

2 結果與分析

2.1 稻瘟菌誘導水稻基因表達芯片數據的分析

根據12 503個水稻基因的芯片檢測數據，轉抗稻瘟病基因株系(NPB/Pi9)在接種后12、24和36 h的表達量分別與其0 h的表達量比較，共檢測到7 754個響應稻瘟菌侵染的差異表達基因，包括4 323個上調和3 743個下調差異表達基因（圖1）。感病基因型日本晴（NPB）在接種后12 h、24 h和36 h共有7 385個差異表達基因，包括4 153個上調和3 588個下調差異表達基因。按照接種時間進程，NPB/Pi9和NPB的差異表達基因數目在接種后24 h達到高峰，在接種后36 h NPB/Pi9的差異表達基因數目略有下降，NPB的差異表達基因數目則顯著下降（圖2）。

比較抗病基因型NPB/Pi9和感病基因型NPB在相同時間點（接種后0 h、12 h、24 h或36 h）的基因表達量，共獲得4 065個差異表達基因，其中接種后0 h、12 h、24 h的差異表達基因數目較少，接種后36 h的差異表達基因數目顯著增加（圖3）。在4個時間點均呈差異表達的差異表達基因有76個（圖4），這些差異表達基因主要編碼蛋白激酶、NBS-LRR抗病蛋白、轉錄因子、轉運相關蛋白、E3連接酶等。

Ⅰ和Ⅲ表示上調表達基因；Ⅱ和Ⅳ表示下調表達基因；N12、N24和N36表示NPB在接種后12 h、24 h和36 h的差異表達基因數目；P12、P24和P36表示NPB/Pi9在接種后12 h、24 h和36 h的差異表達基因數目。

Fig. 1. Number of differentially expressed genes(DEGs) in NPB/Pi9 and NPB after inoculation.

圖2 NPB/Pi9和NPB在接種后的差異表達基因數的變化

Fig. 2. Changes of differentially expressed gene (DEG) number in NPB/Pi9 and NPB after inoculation.

2.2 水稻差異表達基因的GO和KEGG分析

利用Goatools在線軟件對抗感水稻相同時間點的差異表達基因進行生物學途徑（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function, MF）的GO分類富集分析。細胞組分GO分析結果表明，葉綠體或類囊體膜等光合組分的GO分類在接種后0 h及稻瘟病菌侵染的所有時間點顯著富集；細胞外區域GO分類在接種后0 h、24、36 h呈顯著富集（表2）。根據分子功能GO分析結果，轉錄調控因子活性、氧化還原酶活性、離子結合活性的GO分類在0 h及所有接種時間點顯著富集。生物學過程GO分析結果顯示，植物對刺激應答的GO分類在接種后0 h和12 h顯著富集；光合作用以及次生代謝的GO分類分別在接種后12 h、24 h和36 h呈顯著富集；植物激素相關的GO分類在接種后24 h和36 h顯著富集。由此推測，在接種后不同時間，抗病水稻NPB/Pi9與感病水稻NPB的生物學途徑、細胞組分和分子功能相關基因呈顯著差異表達。

圖3 不同接種時間點抗病基因型NPB/Pi9與感病基因型NPB之間的差異表達基因數

Fig. 3. Numbers of differentially expressed genes (DEGs) between the resistant genotype NPB/Pi9 and the susceptible genotype NPB after inoculation.

每一種顏色代表一組差異比較，數字代表不同實驗獨有或共有的基因數，重疊區是代表不同實驗組共有的基因，非重疊區代表不同差異比較組獨有的基因。0 h, 12 hpi, 24 hpi和36 hpi分別代表接種后0 h, 12 h, 24 h和36 h.

Fig. 4. Venn diagram of differentially expressed genes (DEGs) between the resistant genotype NPB/Pi9 and the susceptible genotype NPB.

利用KOBAS在線軟件對抗感水稻的差異表達基因進行KEGG富集分析。在0 h未見任何KEGG通路呈顯著富集。光合作用途徑的KEGG通路在接種后12 h、24 h和36 h顯著富集；苯丙烷合成途徑KEGG通路在接種后24 h和36 h有顯著富集；苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和植物激素信號轉導途徑的KEGG通路在接種后36 h均有顯著富集（表3）。在接種后24 h和36 h，抗感水稻的差異表達基因中分別有18個和42個差異表達基因參與苯丙烷生物合成；在接種后36 h，抗感水稻分別有30個差異表達基因參與苯丙氨酸代謝，9個差異表達基因參與類黃酮生物合成，40個差異表達基因參與植物激素信號轉導。因此，NPB/Pi9和NPB的次生代謝以及植物激素信號轉導途徑在稻瘟病菌接種水稻之后基因表達差異顯著。

表2 NPB/Pi9與NPB之間差異表達基因的GO富集分析結果

2.3 NBS-LRR抗病基因、多種激酶和轉錄因子參與NPB/Pi9的稻瘟病抗性

根據GO分類富集分析結果，在接種后12 h、24 h和36 h，抗感基因型之間多個RPM1和類抗病基因呈差異表達（表4）。WAK和DUF26等類受體蛋白激酶，鈣依賴性蛋白激酶，絲裂原活化蛋白激酶，以及WRKY、MYB、bZIP、ERF/AP2、bHLH等轉錄因子在接種后12 h、24 h和36 h呈差異表達，并且相應差異表達基因的數目隨接種時間進程而增多。

2.4 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與植物激素信號轉導途徑相關

根據抗感基因型差異表達基因的GO和KEGG分析結果，植物激素水楊酸、茉莉酸和乙烯相關差異基因的分類呈顯著富集。其中，水楊酸生物合成途徑(GO: 0009697)和對水楊酸的反應(GO: 0009751)分別在接種后12 h和36 h有顯著富集，相關差異基因主要是MYB轉錄因子和凝集素樣激酶。

表3 稻瘟病菌接種后NPB/Pi9和NPB之間差異表達基因的KEGG富集分析結果

值0.05的通路被認定為顯著富集。

KEGG pathways with correctedvalue 0.05 are regarded as significantly enriched.

表4 稻瘟菌接種后NPB/Pi9和NPB之間的差異表達基因中與激酶和轉錄因子相關的基因

在抗感基因型NPB/Pi9和NPB之間與水楊酸信號轉導相關的差異表達基因中，6個編碼ZIM功能域蛋白的基因在接種后36 h下調表達，2個和3個ZIM基因分別在接種后12 h和24 h下調表達。

在抗感基因型之間與乙烯相關的差異表達基因中，分別有2個乙烯相關基因在接種后12 h和24 h呈差異表達，9個乙烯相關轉錄因子、2個ACC氧化酶基因(Os01g39860、Os09g27820)以及2個乙烯不敏感基因(Os04g38400和Os07g48630)在接種后36 h呈差異表達。因此，水楊酸、茉莉酸以及乙烯信號轉導途徑參與調控NPB/Pi9的稻瘟病抗性。

2.5 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與植物次生代謝途徑相關

苯丙烷生物合成是植物次生代謝的重要途徑之一，與植保素、木質素和酚類物質等抗病化合物的合成相關[12]。根據KEGG通路富集結果，抗感基因型NPB/Pi9和NPB的苯丙烷生物合成、類黃酮代謝以及苯丙氨酸代謝相關基因呈顯著差異表達，其差異表達基因主要是過氧化物酶前體。過氧化物酶前體可形成過氧化物酶體，后者可以調節活性氧，分解過氧化氫從而提高植物抗病性[13]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是植物次生代謝的關鍵酶之一[14]。在抗感基因型的差異基因中檢測到2個基因(Os05g35290，Os02g41680)顯著上調表達，1個基因(Os04g43800.1)顯著下調表達。肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)是木質素生物合成的第一個關鍵酶[15]，苯丙烷生物合成途徑的3個基因發生差異表達。因此，植物次生代謝途徑參與調控介導的稻瘟病抗性。

2.6 NPB/Pi9的稻瘟病抗性與幾丁質酶、硫酸鹽轉運蛋白相關

植物幾丁質酶是一類病程相關蛋白，在植物抵抗病原真菌入侵方面具有重要作用[16]。水稻幾丁質酶活性通常與廣譜抗病性相關[17]。在接種后36 h，NPB/Pi9相對于NPB有3個幾丁質酶（Os04g41620，Os06g51060，Os10g39680）顯著上調表達。把NPB/Pi9在接種后24 h和36 h的基因表達量分別與其0 h的基因表達量比較，上述3個幾丁質酶和另一幾丁質酶(Os08g41100)顯著上調表達。

抗感基因型差異表達基因的富集結果顯示，硫酸鹽轉運蛋白參與離子轉運和膜相關轉運途徑。在接種后36 h，NPB/Pi9相對于NPB有4個硫酸鹽轉運蛋白顯著下調。把NPB/Pi9在接種后12 h、24 h、36 h的基因表達量與其0 h的比較，上述4個轉運蛋白和另一硫酸鹽轉運蛋白(Os09g06499)顯著下調。采用來源于NPB/Pi9和NPB的另一批稻瘟病接種樣品，對部分幾丁質酶基因和硫酸鹽轉運蛋白基因進行qRT-PCR驗證(圖5)，各基因的表達趨勢與其芯片數據(表5)基本一致，表明NPB/Pi9的稻瘟病抗性與幾丁質酶、硫酸鹽轉運蛋白相關。

2.7 基因芯片數據的qRT-PCR驗證

為了驗證水稻基因芯片檢測結果，從另一批稻瘟病接種試驗取NPB/Pi9和NPB水稻樣品，從轉錄因子、病程相關基因等不同功能類別挑選差異表達基因進行定量RT-PCR分析。根據芯片檢測數據（表6）和qRT-PCR驗證結果（圖6），各差異表達基因表達量的變化趨勢基本一致。

數據為平均數±標準差。相同小寫字母表示處理間差異不顯著(P<0.05)。表6同。

Fig. 5. qRT-PCR analysis of differentially expressed genes conferring chitinase and sulfate transporter after inoculation.

圖6 NPB/Pi9和NPB接種后差異表達基因相對表達量的qRT-PCR分析

Fig. 6. qRT-PCR analysis of relative expression levels of differentially expressed genes at different hours after inoculation in NPB/Pi9 and NPB.

表5 NPB/Pi9和NPB水稻基因型中幾丁質酶和硫酸鹽轉運蛋白的基因芯片檢測數據

NPB(或NPB/Pi9)的每個水稻基因在接種后12 h、24 h和36 h的基因表達量的芯片檢測量值，分別與該水稻基因型的相同基因在接種0 h的芯片檢測量值相比，計算兩個量值的比值。0hexp, 12hexp, 24hexp, 36hexp分別表示在接種0, 12, 24 和36 h后的基因相對表達量。

The gene-chip detection value of each rice gene in NPB or NPB/Pi9 at 12, 24 and 36 h after inoculation, respectively, was compared to that of the same gene in the same rice genotype at 0 h, by calculating the ratio of the value of 12 h (24 h or 36 h) after inoculation to the value of 0 h.

表6 NPB/Pi9和NPB水稻基因型中不同功能類別水稻基因的芯片檢測數據

3 討論

本研究采用遺傳背景差異較小的抗病水稻與感病水稻進行比較轉錄組分析，NPB/Pi9和NPB的遺傳差異僅在于轉基因的有無?；趩位虿町惖乃具z傳材料的比較轉錄組研究，更利于解析抗感水稻材料的基因表達差異，進而闡明抗病調控的分子機理。

NBS-LRR抗病基因在植物ETI免疫途徑中起重要作用[5]?？共∷綨PB/Pi9與感病水稻NPB有76個基因在接種后0 h、12 h、24 h和36 h呈差異表達，其中多個差異表達基因屬于基因家族。一類的基因通常呈組成型表達[18]，并且0 h和接種后各時間點抗感水稻的差異表達基因在生物學過程、分子功能、細胞組分方面均有GO分類顯著富集，由此可以解釋抗感水稻的差異表達基因在上述4個時間點呈差異表達。

根據水稻差異表達基因的GO分析結果，在接種后0 h，NPB/Pi9和NPB在生物學過程（包括對刺激的應答、氧化還原過程、轉錄過程），分子功能（包括離子結合活性、轉錄調控因子活性、氧化還原酶活性），細胞組分（包括細胞外區域、葉綠體組分、類囊體膜）方面分別發生顯著差異表達，說明在稻瘟菌侵染之前，NPB/Pi9抗病水稻株系的轉錄調控就已發生顯著改變，這種轉錄重編程現象的根源在于轉基因的作用。Zhang等[9]對NPB遺傳背景的水稻基因RNAi抑制表達轉基因株系和NPB進行比較轉錄組分析，在接種后0 h，檢測到兩種水稻的多個抗病相關基因發生顯著差異表達，說明基因抑制表達導致抗病相關基因的轉錄調控發生改變，進而導致上述RNAi株系和NPB在接種稻瘟病菌后分別呈抗病和感病表型。

抗感水稻光合作用過程和光合組分的GO分類在接種后12 h、24 h和36 h顯著富集，并且抗感水稻光合作用KEGG通路在接種后12 h、24 h和36 h也顯著富集，所以稻瘟菌接種導致兩種水稻基因型的光合功能相關基因產生顯著差異表達。這些可以理解為抗病水稻NPB/Pi9受病菌影響較小，感病水稻NPB因病菌侵染使得其基因表達發生顯著變化。此外，在接種后0 h，抗感水稻的差異表達基因的GO分類還顯著富集于葉綠體組分和類囊體膜，說明NPB/Pi9和NPB在稻瘟菌侵染之前就已存在光合組分相關基因的差異表達。在接種后0 h，NPB/Pi9和NPB之間發生離子結合活性、氧化還原酶活性、轉錄調控因子活性等分子功能的差異表達，可能影響其葉綠體、類囊體膜等細胞組分的功能，從而導致差異表達。

細胞外區域是水稻與稻瘟菌分子互作的主要場所[19]。在接種后24 h和36 h，抗感水稻的差異表達基因的GO分類顯著富集在細胞外區域，說明稻瘟菌在侵染點與水稻細胞表面的分子互作異?；钴S。抗感水稻的WAK、DUF26等多個類受體蛋白激酶在接種12 h、24 h和36 h分別呈顯著差異表達。這些激酶屬于跨膜蛋白，可能在PTI免疫中起到模式識別受體（PRR）[20]的作用。此外，在接種后0 h，抗感水稻的差異表達基因的GO分類也顯著富集在細胞外區域，說明在稻瘟病菌侵染之前，就發生有胞外區域相關水稻基因的差異表達。根據生物學過程的GO分類富集結果，在接種后0 h，抗感水稻差異表達基因的GO分類在植物對刺激應答有顯著富集。因此，NPB/Pi9和NPB的上述胞外相關基因、刺激應答相關基因在接種后0 h呈差異表達的結果，可以通過NPB/Pi9水稻株系中抗病調控途徑發生轉錄重編程作用加以解釋。

WRKY、MYB和NAC轉錄因子參與水稻對生物脅迫和非生物脅迫的反應以及抗病分子調控[21]。在接種后36 h，抗感基因型之間檢測到25個WRKY轉錄因子發生差異表達，其中顯著上調。過表達促進水稻植株體內茉莉酸積累，增強水稻稻瘟病抗性[22]。本研究檢測到負調控JA信號轉導途徑的ZIM功能域蛋白基因，在NPB/Pi9中顯著下調表達，說明在稻瘟菌侵染條件下轉抗病株系的JA信號途徑被激活。因此，基因的抗病功能可能與WRKY30的調控通路相關。

根據抗感基因型NPB/Pi9和NPB差異表達基因的分析結果，苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮代謝等植物次生代謝途徑參與調控介導的稻瘟病抗性。在接種后36 h，MYB轉錄因子呈顯著差異表達，MYB轉錄因子調控苯丙烷的生物合成進而合成木質素、植保素等抗菌物質[12]。木質素合成的關鍵酶PAL也發生差異表達，表明木質素的積累在介導的稻瘟病抗性中具有重要作用。

一類的抗病基因參與ETI免疫途徑[5]。植物R蛋白識別病菌分泌到植物細胞內的效應蛋白，激活ETI免疫反應，導致基因的激活和抗病激素的合成[19]。在稻瘟菌侵染后期，NPB/Pi9的水楊酸信號轉導途徑被激活，幾丁質酶基因顯著上調表達，這些為ETI免疫反應的典型結果。在另一方面，作為水稻與稻瘟菌互作主要場所的細胞外區域在接種后0 h，24 h和36 h發生差異基因GO分類顯著富集，在接種后0 h和12 h發生植物對刺激應答的GO分類顯著富集，并且WAK、DUF26蛋白激酶等跨膜蛋白在接種后12 h、24 h和36 h分別呈顯著差異表達，可能參與水稻細胞和病菌的分子識別，因此NPB/Pi9和NPB差異表達還與PTI免疫途徑相關。研究表明，ETI和PTI共用WRKY等轉錄因子的轉錄調控和MAPK級聯信號轉導等下游信號途徑[23]。NPB/Pi9和NPB的WRKY轉錄因子、MAPK激酶、茉莉酸和乙烯信號途徑在相同時間點呈差異表達。綜上所述，抗感基因型的基因差異表達同時與ETI免疫途徑和PTI免疫途徑相關，ETI和PTI相互聯系并在介導的稻瘟病抗性中發揮作用。

本研究選取不同功能類別的水稻差異表達基因進行qRT-PCR分析，對水稻基因芯片數據進行驗證。qRT-PCR實驗結果所顯示的差異表達趨勢與相應芯片數據基本一致。個別差異表達基因或個別接種時間點的qRT-PCR和芯片數據表現不完全一致的結果，可能源于qRT-PCR和基因芯片實驗條件的波動，或由于水稻RNA樣品來源于不同稻瘟病接種試驗。

水稻抗稻瘟病基因是水稻雜交育種的重要抗源基因[2]。在轉錄水平上解析相關的水稻與稻瘟菌互作的分子機制以及水稻抗病調控途徑，其研究結果豐富了植物抗病分子基礎，為通過雜交育種方法改良水稻稻瘟病抗性以及通過基因編輯和轉基因技術創制水稻抗病種質資源提供理論依據。

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Comparative Transcriptome Analysis of Transgenic Rice Line Carrying the Rice Blast Resistance Gene

XU Zhaomeng1, 2, LI Lihua2, 3, GAO Xiaoqing1, YUAN Zhengjie2, LI Xin2, TIAN Xudan1, 2, WANG Lanlan2,QU Shaohong2, *

(1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;3College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;*Corresponding author, E-mail:squ@mail.zaas.ac.cn)

【】The purpose of the study is to analyze the mechanism behindgene-mediated rice blast resistance at the transcriptional level, and to lay a theoretical basis for breeding disease-resistant rice cultivars. 【】Rice cultivar Nipponbare (NPB) and NPB-transgenic line carrying therice blast resistance gene (NPB/Pi9) were inoculated withLeaf tissues were sampled at 0 h, 12 h, 24 h, and 36 h after inoculation, respectively. Gene-chip transcriptome analysis of 12503 rice genes was performed using the rice samples, and the microarray data were verified by qRT-PCR of a set of differentially expressed genes (DEGs). 【】7754 DEGs were identified by comparing the gene expression levels in the resistant NPB/Pi9 line at 12 h, 24 h and 36 h after inoculation, respectively, to that at 0 h after inoculation. Accordingly, 7385 DEGs were identified in the susceptible rice NPB at the same time points. At 36 h after inoculation, the DEG number of NPB/Pi9 was significantly higher than that of NPB. 4065 DEGs were identified by comparing the gene expression levels in NPB/Pi9 and NPB at the same time points; there were significantly more DEGs at 36 h after inoculationthan at 0 h, 12 hor 24 h after inoculation. Therefore, NPB/Pi9 exhibited more intensive defense responses to. Gene Ontology (GO) and KEGG analyses were carried out on the DEGs between NPB/Pi9 and NPB at the same time points. The GO terms classifications related to extracellular regions, plant response to stimuli, transcriptional regulation, redox activity, ion binding activity, secondary metabolism and plant hormones were significantly enriched for the time points post inoculation. The KEGG pathways of phenylalanine metabolism, flavonoid biosynthesis and plant hormone signaling were enriched significantly at the time points post inoculation. Distinctive gene expression patterns were observed between NPB/Pi9 and NPB at the same time points for the genes of the effector-triggered immunity (ETI) related salicylic acid signaling pathway and chitinase, and the PAMP-triggered immunity (PTI) related extracellular regions, response to stimuli, and lignin biosynthesis. Moreover, distinctive gene expression patterns were observed between NPB/Pi9 and NPB at the same time points for the genes of WRKY transcription factors, MAPK kinases, jasmonate and ethylene signaling pathways that were utilized by both PTI and ETI. Based on all the results, the differential expression patterns between NPB/Pi9 and NPB are related to ETI and PTI, which are involved with each other and play important roles in the-mediated rice blast rice resistance. 【】 Compared with NPB, the resistant genotype NPB/Pi9 showed more intensive defense responses against. Transcription factors, kinases,genes, chitinases, salicylic acid-, jasmonic acid-, and ethylene-signaling pathways, and plant secondary metabolism play important roles ingene-mediated rice blast resistance.

rice blast; transcriptome; resistance genes; plant hormones; secondary metabolism

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2020)03-0245-11

10.16819/j.1001-7216.2020.9126

2019-11-23;

2020-03-11。

國家自然科學基金面上項目（31272016）；浙江省農業科學院省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金資助項目（2010DS700124-ZZ1906）;浙江省農業科學院扶持學科建設2018年B類項目。