液體活檢技術在肺癌診療中的研究進展▲

史琳娜 呂蕊花 賈永軍 任 革 韓 冬 張宏方 賀太平

(1 陜西中醫藥大學醫技學院，西咸新區 712046，電子郵箱：selina-007-520@163.com；2 陜西中醫藥大學附屬醫院影像科，咸陽市 712000)

【提要】 液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術，主要檢測體液中的游離循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA、外泌體、循環RNA等生物標志物，被廣泛用于疾病分子診斷、療效監測和預后評估。近年來，隨著研究的深入及檢測技術的發展，液態活檢在肺癌診療中的應用日益廣泛。本文就近年來液體活檢技術在肺癌診療中的研究進展進行綜述。

肺癌是導致全球癌癥相關發病率和死亡率上升的主要原因，早期診斷率僅為15%，約75%的患者確診時已處于局部晚期或轉移階段[1]。目前，臨床常用的肺癌篩查方法主要包括痰脫落細胞學檢查、支氣管鏡檢查、胸部X光、低劑量計算機斷層掃描和肺組織活檢等[2]。痰脫落細胞學檢查具有無創、經濟、實用、簡單、快速的優點，但敏感性差[3]。支氣管鏡檢查是診斷疑似肺癌患者的主要方法，屬于侵入性的診療方法，并發癥多且敏感性個體差異較大[4]。胸部X光檢查不能完全顯示肺部病變，假陰性率高，敏感性為75%～80%[5]。低劑量計算機斷層掃描檢測肺部病變敏感性較高，但假陽性率亦高，且有輻射暴露的風險[6]。肺組織活檢所需的組織樣本需通過手術獲得，取樣不足和腫瘤內部的異質性可降低檢測的準確性[7]。液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術，相較于其他肺癌篩查方法，具有無創、標本易獲得且可重復獲取的優點，可用于肺癌的精準治療、預后評估和療效監測[8]。液體活檢檢測對象主要包括游離循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、外泌體及循環RNA。其中CTC和ctDNA檢測是發展最迅速的兩個研究領域。本文對液體活檢在肺癌診療中的研究進展進行綜述，以期為肺癌的精準醫療提供更好的參考。

1 CTC

1.1 CTC的概念及檢測方法 CTC是從原發性腫瘤和/或轉移病變脫落并在血流中循環的腫瘤細胞，細胞表面可表達上皮細胞特異性分子，如上皮細胞黏附分子和細胞角蛋白，低表達白細胞特異性分子CD45[9]。與其他循環腫瘤生物標志物相比，CTC的優勢是可通過直接觀察CTC細胞形態確定腫瘤的惡性表型。此外，免疫細胞化學和熒光原位雜交可用于CTC的表型鑒定并檢測基因組變化。體外培養CTC建立永久性CTC細胞系，可用于各種體內、體外的功能實驗，并可用于藥物篩選，有助于腫瘤的個體化治療[10]。外周血中的CTC含量極低[1～10 CTC/(106血細胞·mL 血)]，因此，CTC分選富集技術是臨床應用的重點和難點。目前CTC分選富集常用的方法有親和性富集法(包括上皮細胞因子陽性富集法和白細胞去除法)、膜濾過分離腫瘤細胞技術、密度梯度離心法、微流控芯片技術、免疫磁珠技術、電泳技術、免疫熒光法等，各有優缺點[11]，見表1。

表1 CTC分選富集技術的優缺點比較

1.2 CTC臨床應用進展 CTC包含多種細胞和亞細胞成分，通過分析其組分可獲取腫瘤的病變信息，如獲取DNA分析已知突變和發現新突變，獲取RNA可得到基因表達譜及進行腫瘤細胞蛋白質組學分析，CTC在肺癌的診斷、治療評估和復發監測等方面具有潛在的應用價值，已廣泛應用于臨床前研究和臨床試驗[11]。研究發現葉酸受體陽性的CTC可用于肺癌的早期診斷，其診斷Ⅰ期肺癌的敏感性和特異性分別為74.19%和73.08%，其受試者工作特征曲線的曲線下面積優于癌胚抗原、神經元特異性烯醇化酶、細胞角蛋白19片段等其他臨床腫瘤標志物[12]。盡管化療、靶向小分子和免疫檢查點抑制劑治療肺癌已顯示出顯著效果，但獲得性耐藥和腫瘤復發仍舊十分常見。Zhou等[13]的研究證實了CTC計數與肺癌患者癌胚抗原表達水平和轉移灶數量呈正相關，并能有效預測預后。Chinniah等[14]對48例接受化療的局部晚期肺癌患者進行縱向血液CTC監測，證實CTC可預測腫瘤復發并先于影像學證據出現。因此，通過連續取樣，對患者CTC進行縱向分析、監測腫瘤的演變，對腫瘤耐藥和復發研究具有重要意義[15]。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的概念及檢測方法 ctDNA是從凋亡或壞死的腫瘤細胞中釋放出來的遺傳物質，可反映腫瘤的遺傳特征。研究證實，ctDNA與腫瘤組織活檢中獲得的腫瘤突變譜具有較高的一致性，可作為治療效果評價指標與治療后臨床隨訪的重要監測指標[16]。目前，ctDNA檢測技術主要包括等位基因特異性PCR、數字PCR和二代測序技術，每種技術都有各自的優缺點[17]，見表2。

表2 ctDNA檢測方法的優缺點比較

2.2 ctDNA臨床應用進展 ctDNA具有廣泛的臨床應用價值，可用于肺癌靶向治療致癌驅動基因(如鼠類肉瘤病毒癌基因、磷酸酶和張力蛋白同源物基因、表皮生長因子受體基因、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1基因等)的突變檢測，以實現腫瘤的精準治療。中國國家食品藥品監督管理總局于2015年2月批準吉非替尼說明書更新，更新后的說明書指出在無法獲得腫瘤組織時，可通過血液ctDNA檢測表皮生長因子受體基因突變指導吉非替尼治療[18]。研究表明，ctDNA(3 d)比組織樣本(10～14 d)能更快得到驅動基因的檢測結果，且取樣方法簡單并可重復取樣，實現了療效和耐藥性的實時監測[19]。Xing等[20]對36例肺腺癌患者在使用奧希替尼治療前后的ctDNA樣本進行體細胞突變譜分析，發現ctDNA變化與治療效果和預后顯著相關 。一項針對納武利尤單抗治療晚期肺癌的研究證實，外周血中ctDNA濃度的降低預示療效和預后較好[21]。另有研究表明，從ctDNA中檢測驅動基因—表皮生長因子受體基因的突變豐度可反映表皮生長因子受體靶向藥物的療效和預后，且比癌胚抗原和神經元特異性烯醇化酶等常用生物標記物更敏感[22]。綜上，ctDNA可指導肺癌治療，用于療效評價、耐藥性檢測和預后評估，在肺癌個體化治療和全程管理中具有巨大優勢。

3 外泌體

3.1 外泌體的概念及檢測方法 外泌體可在血液、尿液、腦脊液、胸膜積液等多種體液中被檢測到，是直徑為30～100 nm的細胞外囊泡，由包括腫瘤細胞在內的多種細胞分泌產生，其主要功能是遞送各種生物分子(蛋白質、DNA和RNA等)到靶細胞[23]。研究發現，腫瘤細胞分泌的外泌體可促進腫瘤的發生、發展和轉移，促進腫瘤血管生成，參與腫瘤免疫調節和耐藥性發生[24]。目前，基于外泌體的理化性質和生化特性，學者們開發了一系列分離技術，表3對其主要分離技術的優缺點進行了總結[25]。

表3 外泌體分離技術的優缺點比較

3.2 外泌體臨床應用進展 肺癌的形成和發展受多種因素和機制影響，肺癌細胞分泌的外泌體作為細胞間信息傳遞的介質在這一過程中起著至關重要的作用[26]。外泌體富含多種與肺癌發生發展相關的蛋白，如表皮生長因子受體、鼠類肉瘤病毒癌基因蛋白、緊密連接蛋白和RAB蛋白家族等，這些蛋白可作為肺癌診斷的生物標志物[27]。大量研究發現，外泌體中蛋白質和RNA表達水平的改變與腫瘤進展顯著相關，可作為評價肺癌預后的潛在生物標志物，進而指導臨床治療。Sandfeld-Paulsen等[28]的研究證實外泌體膜結合蛋白紐約食管鱗狀細胞癌1、胎盤堿性磷酸酶、表皮生長因子受體、凋亡相關基因2相互作用蛋白X和上皮細胞黏附分子與肺癌患者總體生存時間顯著相關。Liu等[29]的研究證實外泌體中微小RNA-10b-5p、微小RNA-23b-3p和微小RNA-21-5p水平與肺癌患者總體生存時間呈負相關。研究發現外泌體可干預肺癌的治療效果，例如外泌體的微小RNA-1246可通過促進肺癌細胞增殖導致放療抗性增加[30]，外泌體鋅指E盒結合蛋白1 mRNA可誘導肺癌細胞化療抗藥性的產生[31]，外泌體微小RNA-21通過下調蛋白酪氨酸磷酸酶和程序性細胞死亡蛋白4的表達，激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，參與肺癌患者表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥的發生[32]。此外，外泌體還可以作為天然藥物載體，例如用外泌體包裹紫杉醇制備的新型納米制劑，在肺癌轉移小鼠模型中被證實有顯著治療效果[33]。隨著深入研究外泌體在肺癌發生發展中的生物學機制，將外泌體作為診斷和治療肺癌的新手段具有廣闊的前景。

4 循環RNA

循環RNA是指存在于血液或其他體液中的胞外RNA，包含mRNA、微小RNA、長鏈非編碼RNA和其他類型RNA，由細胞主動分泌和/或細胞凋亡后釋放產生。循環RNA參與腫瘤的發生發展，對腫瘤生長發揮促進或抑制作用。隨著二代測序技術的發展，通過篩查肺癌患者與正常對照人群體液樣本中差異表達的循環RNA，不僅可作為診斷/預后候選標記物，還可成為潛在的治療靶點[34]。Luo等[35]發現長鏈非編碼RNA H19在肺癌患者血漿中明顯升高，可用于肺癌的輔助診斷。長鏈非編碼RNA-MIR22HG被證實具有腫瘤抑制因子的作用，可作為肺癌新的治療靶點[36]。目前針對肺癌特異性循環RNA篩查的基礎實驗和臨床研究不斷涌現，循環RNA在肺癌發生發展中的作用也逐漸被證實，循環RNA分子檢測技術將會在肺癌診斷和治療中發揮越來越重要的作用。

5 小 結

液體活檢在肺癌診療中發揮著巨大作用，可用于肺癌的早期診斷、驅動基因的檢測、治療方案的制定以及療效和復發的監測，從根本上促進腫瘤精準醫學的發展。液體活檢是一項具有挑戰性的新技術，隨著研究地不斷深入，越來越多的研究成果將有望實現成果轉化，從而更好地為臨床服務。為使液體活檢能更廣泛應用于臨床，不僅需要提升檢測技術的靈敏度和特異性、擴大臨床試驗規模，還需要建立相應的檢測標準，建設規范的監管體系。